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Development of an indirect ELISA against Equine Herpesvirus Types 1 and 4
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Authors
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Abstract(s)
The equine herpesviruses are important pathogens in the animal health context, namely in the equine’s health. So far, nine types have been identified, of which herpesvirus type 1 (EHV-1) and type 4 (EHV-4) are clinically, economically, and epidemiologically the most relevant due to the pathologies associated.
The main objective of this work was to develop a peptide-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for discrimination between EHV-1 and EHV-4. Selecting from the literature the immunogenic regions of both viruses, the tests were performed using a portion of glycoprotein E and a portion of glycoprotein G from each virus type.
The results obtained until the conclusion of this work are promising, however, they were not conclusive. Nevertheless, they open the way for future testing, in order to make these ELISA test applicable for the detection of antibodies against EVH-1 and EHV-4.
Este trabalho experimental teve como principal objetivo o desenvolvimento de um teste ELISA que permitisse detetar e diferenciar o herpesvírus equino tipo 1 (EHV-1) e o herpesvírus equino tipo 4 (EHV-4). Os herpesvírus equinos (EHVs) são vírus envelopados, com dupla cadeia de DNA que afetam todos os membros da família Equidae em todo o mundo (Wegdan et al., 2016; Slater, 2007), tendo sido, até ao momento, identificados e caracterizados nove tipos de herpesvírus. Os vírus dos tipos EHV-1, EHV-2, EHV-3, EHV-4 e EHV-5 infetam cavalos domésticos, enquanto os vírus dos tipos EHV-6, EHV-7, EHV-8 e EHV-9 estão associados a equídeos selvagens (Slater, 2007). Estes vírus possuem ciclos de vida complexos, que envolvem a infeção de múltiplos tipos celulares em diferentes tecidos e, são ainda detentores de diferentes mecanismos de evasão que lhes permite escapar à resposta imunológica do hospedeiro (Slater, 2007). Uma das ferramentas mais poderosas destes vírus é a capacidade de permanecer em latência, estado esse em que os equinos transportam o vírus de forma assintomática durante longos períodos. (Ostlound,1993; Balasuriya et al, 2015 Slater, 2007). Devido às suas características, os EHVs têm tido, a nível mundial e em todos os sectores da indústria equestre, um grande impacto económico e no bem-estar animal. (Slater, 2007; Milic et al., 2018). Contudo, de entre os EHVs, o EHV-1 e EHV-4 são do ponto de vista clínico, económico e epidemiológico os agentes patogénicos mais relevantes (Patel & Heldens, 2005; Slater, 2007). O EHV-1 é maioritariamente responsável por doenças respiratórias em animais jovens, aborto, morte neonatal e surtos extensivos de doença neurológica ou mielencefalopatia por herpesvírus equino (EHM), enquanto que o EHV-4 causa principalmente doenças respiratórias e raramente leva ao aborto (Ostlund, 1993; Balasuriya et al, 2015; Milic et al, 2018). Os vírus EHV-1 e EHV-4 foram em tempos considerados e classificados como dois subtipos do mesmo vírus (Milic et al., 2018). No entanto, a utilização da sequenciação genómica permitiu diferenciar estes dois vírus que são, contudo, geneticamente muito semelhantes (Vandekerckhove et al., 2011; Azab et al., 2012; Wegdan, 2016; Milic et al., 2018). Tendo em conta estas semelhanças entre os vírus, foram selecionadas para este trabalho, com base na literatura, duas regiões altamente imunogénicas que permitissem diferenciá-los sem que ocorresse reação cruzada. As regiões escolhidas foram uma porção do gene que codifica para a glicoproteína G (gG) e uma outra porção do gene que codifica para a glicoproteína E (gE). As glicoproteínas do herpesvírus estão presentes no envelope do vírus e têm papéis funcionais importantes na patogénese da doença (Crabb&Studdert,1990; Molinková,2012), mediando a entrada do vírus na célula hospedeira através da adsorção e penetração (Crabb & Studdert, 1990; Patel & Heldens, 2005; Slater, 2007). A maioria das diferenças entre EHV-1 e EHV-4 foram encontradas em 1993 por Crabb & Studdert na extremidade 3' do gene 70 que codifica a glicoproteína G. Comparando as sequências nucleotídicas de EHV-4 gG e EHV-1 gG, estes autores concluíram que as sequências possuíam 58% de identidade. No entanto, as regiões proteicas que incluíam os resíduos de aminoácidos 287 a 382 em EHV4 gG e 288 a 350 em EHV1 gG detinham apenas 21% de identidade. Por este motivo, esta região foi indicada como uma das mais promissoras na distinção de ambos os vírus. (Van Maanen, 2012; Thormann et al., 2012). Mais tarde, Damiani et al. (2000) examinaram mutantes de supressão do heterodímero gI/gE em EHV-4, em condições in vitro e in vivo, concluindo que os genes intactos destas glicoproteínas, gI e/ou gE, são necessários para uma transmissão eficaz do vírus através da propagação de célula a célula e, consequentemente, existe um papel importante dos genes gI e gE na virulência do EHV-4. Com base nestas descobertas, Andoh et al. (2012) identificaram e descreveram epítopos imunogénicos de EHV-1 e EHV-4 fundados em gE. Após o reconhecimento das regiões a utilizar, o presente trabalho foi desenhado de forma a obter estas proteínas recombinantes. Numa primeira fase, foram construídos dois vetores de expressão, cada um contento a porção imunogénica de gG de EHV-1 e EHV-4 para posterior transformação e expressão num organismo modelo neste caso, a bactéria Escherichia coli. E, em paralelo, o trabalho prosseguiu usando dois péptidos sintéticos de gE, um para cada um dos herpesvírus em estudo. A fase seguinte deste trabalho englobou o desenvolvimento de um teste ELISA, teste esse que tem como base reações antigénio-anticorpo detetáveis por meio de reações enzimáticas e têm sido utilizados para identificar estados de infeção e/ou vacinação de forma rápida e precisa. O ELISA desenvolvido foi do tipo indireto onde a ligação antigénio-anticorpo é detetada por um segundo anticorpo marcado o que confere uma maior especificidade e sensibilidade ao teste. No final, foi possível desenvolver e otimizar um teste ELISA indireto que permite a deteção de soros positivos e também a diferenciação de EHV-1 e EHV-4. No entanto, embora os resultados obtidos sejam promissores, trabalho futuro será necessário para testar um maior número de soros de forma a validar o teste ELISA e torná-lo apto para utilização em laboratório.
Este trabalho experimental teve como principal objetivo o desenvolvimento de um teste ELISA que permitisse detetar e diferenciar o herpesvírus equino tipo 1 (EHV-1) e o herpesvírus equino tipo 4 (EHV-4). Os herpesvírus equinos (EHVs) são vírus envelopados, com dupla cadeia de DNA que afetam todos os membros da família Equidae em todo o mundo (Wegdan et al., 2016; Slater, 2007), tendo sido, até ao momento, identificados e caracterizados nove tipos de herpesvírus. Os vírus dos tipos EHV-1, EHV-2, EHV-3, EHV-4 e EHV-5 infetam cavalos domésticos, enquanto os vírus dos tipos EHV-6, EHV-7, EHV-8 e EHV-9 estão associados a equídeos selvagens (Slater, 2007). Estes vírus possuem ciclos de vida complexos, que envolvem a infeção de múltiplos tipos celulares em diferentes tecidos e, são ainda detentores de diferentes mecanismos de evasão que lhes permite escapar à resposta imunológica do hospedeiro (Slater, 2007). Uma das ferramentas mais poderosas destes vírus é a capacidade de permanecer em latência, estado esse em que os equinos transportam o vírus de forma assintomática durante longos períodos. (Ostlound,1993; Balasuriya et al, 2015 Slater, 2007). Devido às suas características, os EHVs têm tido, a nível mundial e em todos os sectores da indústria equestre, um grande impacto económico e no bem-estar animal. (Slater, 2007; Milic et al., 2018). Contudo, de entre os EHVs, o EHV-1 e EHV-4 são do ponto de vista clínico, económico e epidemiológico os agentes patogénicos mais relevantes (Patel & Heldens, 2005; Slater, 2007). O EHV-1 é maioritariamente responsável por doenças respiratórias em animais jovens, aborto, morte neonatal e surtos extensivos de doença neurológica ou mielencefalopatia por herpesvírus equino (EHM), enquanto que o EHV-4 causa principalmente doenças respiratórias e raramente leva ao aborto (Ostlund, 1993; Balasuriya et al, 2015; Milic et al, 2018). Os vírus EHV-1 e EHV-4 foram em tempos considerados e classificados como dois subtipos do mesmo vírus (Milic et al., 2018). No entanto, a utilização da sequenciação genómica permitiu diferenciar estes dois vírus que são, contudo, geneticamente muito semelhantes (Vandekerckhove et al., 2011; Azab et al., 2012; Wegdan, 2016; Milic et al., 2018). Tendo em conta estas semelhanças entre os vírus, foram selecionadas para este trabalho, com base na literatura, duas regiões altamente imunogénicas que permitissem diferenciá-los sem que ocorresse reação cruzada. As regiões escolhidas foram uma porção do gene que codifica para a glicoproteína G (gG) e uma outra porção do gene que codifica para a glicoproteína E (gE). As glicoproteínas do herpesvírus estão presentes no envelope do vírus e têm papéis funcionais importantes na patogénese da doença (Crabb&Studdert,1990; Molinková,2012), mediando a entrada do vírus na célula hospedeira através da adsorção e penetração (Crabb & Studdert, 1990; Patel & Heldens, 2005; Slater, 2007). A maioria das diferenças entre EHV-1 e EHV-4 foram encontradas em 1993 por Crabb & Studdert na extremidade 3' do gene 70 que codifica a glicoproteína G. Comparando as sequências nucleotídicas de EHV-4 gG e EHV-1 gG, estes autores concluíram que as sequências possuíam 58% de identidade. No entanto, as regiões proteicas que incluíam os resíduos de aminoácidos 287 a 382 em EHV4 gG e 288 a 350 em EHV1 gG detinham apenas 21% de identidade. Por este motivo, esta região foi indicada como uma das mais promissoras na distinção de ambos os vírus. (Van Maanen, 2012; Thormann et al., 2012). Mais tarde, Damiani et al. (2000) examinaram mutantes de supressão do heterodímero gI/gE em EHV-4, em condições in vitro e in vivo, concluindo que os genes intactos destas glicoproteínas, gI e/ou gE, são necessários para uma transmissão eficaz do vírus através da propagação de célula a célula e, consequentemente, existe um papel importante dos genes gI e gE na virulência do EHV-4. Com base nestas descobertas, Andoh et al. (2012) identificaram e descreveram epítopos imunogénicos de EHV-1 e EHV-4 fundados em gE. Após o reconhecimento das regiões a utilizar, o presente trabalho foi desenhado de forma a obter estas proteínas recombinantes. Numa primeira fase, foram construídos dois vetores de expressão, cada um contento a porção imunogénica de gG de EHV-1 e EHV-4 para posterior transformação e expressão num organismo modelo neste caso, a bactéria Escherichia coli. E, em paralelo, o trabalho prosseguiu usando dois péptidos sintéticos de gE, um para cada um dos herpesvírus em estudo. A fase seguinte deste trabalho englobou o desenvolvimento de um teste ELISA, teste esse que tem como base reações antigénio-anticorpo detetáveis por meio de reações enzimáticas e têm sido utilizados para identificar estados de infeção e/ou vacinação de forma rápida e precisa. O ELISA desenvolvido foi do tipo indireto onde a ligação antigénio-anticorpo é detetada por um segundo anticorpo marcado o que confere uma maior especificidade e sensibilidade ao teste. No final, foi possível desenvolver e otimizar um teste ELISA indireto que permite a deteção de soros positivos e também a diferenciação de EHV-1 e EHV-4. No entanto, embora os resultados obtidos sejam promissores, trabalho futuro será necessário para testar um maior número de soros de forma a validar o teste ELISA e torná-lo apto para utilização em laboratório.
Description
Keywords
Herpesvírus EHV-1 EHV-4 Serologia ELISA Péptido Equino