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Interaction of vanadium compounds with DNA

2013Doctoral thesis Open access
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datacite.subject.fosCiências Naturais::Ciências Químicaspt_PT
dc.contributor.advisorCavaco, Isabel Maria Palma Antunes
dc.contributor.authorButenko, Nataliya
dc.date.accessioned2015-10-07T11:07:49Z
dc.date.available2015-10-07T11:07:49Z
dc.date.issued2013
dc.date.submitted2013
dc.descriptionTese de doutoramento, Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2013
dc.description.abstractThe DNA cleavage activity of several vanadium complexes (VC) was studied. The focus was on vanadium acetylacetonate, VIVO(acac)2, 1, and several β-diketonate oxidovanadium(IV/V) derivatives: VIVO(hd)2 (2, hd = 3,5-heptanedione), VIVO(Cl-acac) 2, (3, Cl-acac = 3-chloro-2,4-pentanedione), VIVO(Et-acac)2 (4, Et-acac = 3-ethyl- 2,4- pentanedione) and VIVO(Me-acac)2 (5, Me-acac = 3-methyl-2,4-pentanedione), VV2O4(acac)2 (6), VVO2(acac)(phen) (7, phen = 1,10-phenanthroline) and VVO(OH)(OMe)(acac) (8). The nuclease activity of 28 additional vanadium, copper and nickel complexes was also analysed and compared. The experimental techniques involved digestion of plasmid DNA (pDNA) followed by agarose gel electrophoreses to evaluate nuclease efficiency. pDNA was prepared and purified to assure the absence of interference from EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) and Tris present in commercial pDNA. The stability of complexes in aqueous solutions was studied by UV/vis spectroscopy and electroanalytical techniques, cyclic (CV) and square wave voltammetry (SWV). The nature of DNA cleavage mechanisms was assayed using fluorescent probes and 1H and 51V NMR spectroscopy. VIVO(acac)2 was found to be efficient in cleaving pDNA. The extent of this pDNA cleavage is dependent on buffer media. In organic buffers (Tris, HEPES MOPS) no significant changes are observed, whereas in phosphate medium the nuclease activity is remarkable. The activity of the different complexes follows the order 3>1≥2>>4~5. The V(V) derivatives, 6-8, do not show any significant activity, except in the presence of an oxidant activating agent. CV results show that 1-3 have a quasi-reversible electrochemical behaviour, while of 4 and 5 have an irreversible one, similar to 6. The DNA cleavage by these complexes takes place through an oxidative mechanism. Complex 1 also cleaves DNA hydrolytically, however the reaction is too slow to compete with the radical mechanism. In conclusion, phosphate buffer potentiates the DNA cleavage by VIVO(acac)2 derivatives through a species which presents a quasi-reversible redox behaviour and facilitates the formation of ROS, probably a mixed V(IV)-V(V)-acac-phosphate complex.pt_PT
dc.description.abstractEste trabalho estuda a interação de complexos de vanádio com ADN, em particular a atividade nuclease do acetilacetonato de oxovánadio(IV), VIVO(acac)2, 1, e alguns dos seus derivados: VO(hd)2 (2, hd = 3,5-heptanodiona), VO(Cl-acac)2, (3, Cl-acac = 3-cloro-2,4-pentanodiona), VO(Et-acac)2 (4, Et-acac = 3-etil-2,4-pentanodiona) e VO(Me-acac)2 (5, Me-acac = 3-metil-2,4-pentanodiona), V2O4(acac)2 (6), VO2(acac)(phen) (7, phen = 1,10-fenantrolina) and VO(OH)(OMe)(acac) (8). O objetivo inicial foi identificar a(s) espécie(s) metálicas presentes em solução responsáveis pela degradação do ADN. A atividade nuclease de seis compostos de vanádio e três compostos de cobre contendo aminoácidos e 1,10-fenantrolina e/ou 2,2‟-bipiridina como co-ligandos, 10-36, foi também analisada. A eficiência da clivagem do ADN pelos complexos metálicos em soluções tamponizadas a pH 7 foi determinada por electroforese em gel de agarose. Comparou-se o efeito de diferentes tampões de pH sobre a atividade. A estabilidade dos complexos em solução aquosa foi estudada por espectroscopia de absorção molecular no UV-Vis e por técnicas electroanalíticas (voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada). A natureza radicalar ou hidrolítica dos mecanismos de clivagem foi averiguada recorrendo a compostos modelo e usando técnicas de fluorescência molecular e de ressonância magnética nuclear. O VO(acac)2 mostrou ser extremamente eficiente na clivagem de ADN (pADN), em particular em soluções tamponizadas com fosfato. Não requer agentes ativadores, ar ou fotoirradiação para degradar o pADN. A clivagem de uma cadeia simples (“nicking”) observa-se na presença de concentrações de metal na ordem dos 1,2 μM (correspondendo a ri = 0,08, onde ri é a razão da concentração de metal para a concentração do ADN, em pares de bases). A extensão da clivagem aumenta à medida que a concentração de 1 aumenta, e para concentrações de metal da ordem dos 10 μM (ri = 0,7) observa-se a clivagem da dupla cadeia. Quando ri = 1,7 observa-se a degradação completa da forma superenrolada (Sc) do pADN. Todos os complexos estudados apresentam atividade nuclease, dependente da concentração. O complexo 2 é uma nuclease um pouco menos eficiente do que 1, atingindo a degradação completa da forma Sc para ri = 3,3. O complexo 3 é muito pouco solúvel em solução aquosa, mas ainda assim demonstra uma atividade nuclease razoável, sugerindo ser mais eficiente do que os anteriores. Os complexos 4 e 5 têm atividades semelhantes e muito inferiores a 1, não chegado a linearizar o pADN excepto para ri > 6,7. Os complexos 4 e 5 promovem a clivagem simples de uma cadeia a ri = 1,7. O VOSO4 é frequentemente considerado um controlo negativo em ensaios de atividade nuclease de compostos de vanádio. Neste estudo verificou-se que o VOSO4 (9) tem um comportamento pouco reprodutível, nalguns ensaios apresenta uma atividade nuclease dependente da concentração tão forte como 1, enquanto noutros não apresenta qualquer atividade. É possível que esta falta de reprodutibilidade seja devida nalguns casos precipitação do oxovanádio como hidróxido. A precipitação resulta em pouca ou nenhuma atividade observada. Caso as condições da precipitação e a sua extensão sejam irreprodutíveis, a atividade observada resulta também irreprodutível. A estabilidade em solução aquosa dos complexos 1–5 e 9 foi avaliada por espectroscopia de absorção molecular no UV/Vis. Verificou-se que 1 e 2 são razoavelmente estáveis nas primeiras 24 h em tampão fosfato, havendo apenas pequenas alterações no espectro ao fim de 2-4 h. Os complexos 4 e 5 têm um comportamento totalmente diferente, observando-se uma hidrólise significativa em menos de 1 h. O mesmo sucede com o complexo 9. O complexo 3 não é suficientemente solúvel em água, mas é muito estável em DMSO. A diferente atividade dos complexos relaciona-se com a sua estabilidade em solução aquosa, seguindo a ordem 1≥2>>4~5. As nucleases fracas (4 e 5) são complexos instáveis que são rapidamente oxidados e hidrolisados a complexos de V(V) durante a primeira hora após dissolução numa solução tamponizada a pH 7. Esta observação é confirmada pelos resultados de voltametria cíclica: 1-3 apresentam um comportamento semelhante entre si, e muito diferente de 4 e 5. O comportamento electroquímico dos primeiros é quase-reversível, enquanto o dos segundos é claramente irreversível com um voltamograma semelhante ao do derivado de oxovanádio(V) (6). Estudos de atividade nuclease dos complexos na presença de excesso de ligando mostram que deve ser outra espécie que não VIVOL2 a responsável pela atividade. A adição de excesso de ligando favorece a formação desta espécie em solução, relativamente ao metal livre e ao complexo VIVOL+. Ao adicionar excesso de acac a 1, observa-se uma diminuição progressiva da atividade à medida que a razão ligando/metal aumenta de 80 para 160. O efeito da presença de agentes redutores e de agentes oxidantes foi testada juntando oxona ou ácido mercaptopropiónico (MPA) à mistura reacional. Observou-se que a oxona favorece a eficiência da clivagem por 1. Por outro lado, o MPA reduz a atividade nuclease destes compostos, mas não totalmente. Estes efeitos são observados tanto quando a digestão é feita ao ar como em atmosfera de azoto. A presença de H2O2 favorece fortemente a clivagem. O aumento da concentração de H2O2 tem um efeito muito menos significativo na degração do pADN do que o aumento da concentração de complexo. A atividade nuclease dos derivados de oxidovanádio(V), 6-8, faz-se notar apenas na presença de oxona e em tampão fosfato. É improvável que o monovanadato (V1), o produto mais comum da hidrólise e oxidação do vanádio(IV) em solução aquosa, seja a espécie responsável pela atividade nuclease de 1. Por si só, o V1 não exerce efeitos no pADN. Embora na presença de oxona possa causar clivagem da cadeia simples, é muito menos eficiente do que 1. A natureza e a concentração do tampão de pH são determinantes para a atividade nuclease. Demonstra-se que a extensão da clivagem do pADN causada por 1 depende grandemente do meio tampão, sendo maior em tampão fosfato do que em tampões orgânicos como HEPES, Tris e MOPS. A reação é sempre inibida na presença de MOPS, mesmo quando existe excesso de fosfato em solução, mas progride até à linearização do pADN na ausência daquele. O efeito do tampão foi estudado por electroforese em gel de agarose, espectroscopia de UV-Vis, voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada e RMN de 1H e 51V. Os resultados apontam para que as espécies responsáveis pela degradação observada no ADN em tampão fosfato sejam provavelmente espécies mistas contendo V(IV) e V(V), e os ligandos acac e fosfato, apresentando um comportamento redox quase reversível. Os resultados de voltametria de onda quadrada indicam a formação de pelo menos três espécies diferentes, possivelmente: VO(acac)2(H2PO4)-, VO(acac)(H2PO4 )2- e VO(H2PO4)2. A clivagem do ADN ocorre através de um mecanismo radicalar. A formação de radicais OH foi observada em ensaios de hidroxilação do ácido tereftálico (TPA), um método muito sensível para a sua detecção. Observa-se um aumento notável na intensidade de fluorescência, devida à formação de ácido hidroxitereftálico, ao misturar TPA com soluções aquosas de 1. Na presença de H2O2 a intensidade de fluorescência torna-se muito mais alta do que na sua ausência, confirmando a libertação de OH. No entanto é possível que o radical superóxido ou radicais ligados ao complexo metálico sejam de fato as ROS que causam a clivagem oxidativa observada na ausência de agentes oxidantes. Estudos por RMN de 1H e 51V, com modelos da ligação fosfodiéster mostram que o VO(acac)2 é capaz de clivar e promover a clivagem hidrolítica do ADN, e que as espécies responsáveis são provavelmente tetravanadatos. No entanto, esta hidrólise é demasiado lenta (>24 h a 50 ºC) para competir com a reação radicalar que ocorre no tempo de incubação típico de 1 h a 37ºC. A atividade nuclease de outros complexos de oxidovanádio(IV) e alguns complexos de cobre foi também avaliada e discutida. Os complexos VO(acac-Naf)2 (10, acac-Naf = acetonaftalina), VO(tmh)2 (11, tmh = 2,2,6,6-tetrametil-3,5-heptanodiona), VO(pbd)2 (12, pbd = 1-Fenil-1,3-butadiona)), VO(acac-NH2)2 (13, acac-NH2 = acetoacetamida), VO(acac-NMe2)2 (14, N,N-dimetilacetoacetamida) são outros derivados de 1 que foram estudados neste trabalho. Com a excepção de 10, que não induz qualquer clivaegem do ADN, 11-14 promovem a clivagem simples da dupla cadeia. Cu(acac)2 (15) e Ni(acac)2 (16) foram testados como complexos com uma estrutura quadrangular plana, com coordenação semelhante a 1. Ao contrário de 16, que não apresenta qualquer atividade nuclease, 15 induz “nicking”, mas aparentemente não dependente da concentração de complexo. A adição de agentes ativadores aumenta significativamente a atividade nuclease de 15, especialmente na presença de MPA, situação em que se observa a destruição completa do pADN. Este efeito do MP sugere um mecanismo radicalar desencadeado pela redução do Cu(II) a Cu(I) pelo MPA. O complexo 16 também não apresenta efeitos sobre o ADN na presença de MPA. Outro grupo de complexos estudados contém ácido picolínico na sua estrutura: VO(MPA)2 (17, MPA = ácido 6-metil-2-picolínico), VO(dmpp)2 (18, dmpp = 1-(3,4-dimetil-fenil)-piperazina) e VO(PA)2 (19, PA = ácido picolínico). O complexo 19 é o mais ativo, seguido de 17 e 18. Tanto as bandas Nck como Lin aparecem para concentações de 25, 50 e 100 μM (ri 1.67, 3,3 e 6,7, respetivamente). VO(oda) (20), VO(oda)phen (21) e VO(oda)bipy (23), onde “oda” é o ligando oxodiacetato e phen denota fenantrolina, são outros exemplos de nucleases eficientes. VO(phen)2 (22) foi estudado como termo de comparação. Os quatro complexos interagem prontamente com o pADN, causando clivagem simples e dupla. VO(morin)2 (24), VO(chrysin)2 (25), VO(clor) (26), e VO(silibinin)2 (27), complexos que demonstaram efeitos antitumurais, não promovem qualquer clivagem significativa, mesmo quando ativados com oxona ou MPA.pt_PT
dc.description.sponsorshipErasmus Mundus External Cooperation Window Lot 6
dc.identifier.tid101289766
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10400.1/6864
dc.language.isoengpt_PT
dc.relationINTERACTION OF VANADIUMIV COMPLEXES WITH DNA
dc.subjectBioquímicapt_PT
dc.subjectVanádiopt_PT
dc.subjectADNpt_PT
dc.subjectNucleases de venádiopt_PT
dc.titleInteraction of vanadium compounds with DNApt_PT
dc.typedoctoral thesis
dspace.entity.typePublication
oaire.awardTitleINTERACTION OF VANADIUMIV COMPLEXES WITH DNA
oaire.awardURIinfo:eu-repo/grantAgreement/FCT//SFRH%2FBD%2F69444%2F2010/PT
person.familyNameNatalia
person.givenNameButenko
person.identifier.orcid0000-0002-0214-8987
person.identifier.ridC-2152-2018
project.funder.identifierhttp://doi.org/10.13039/501100001871
project.funder.nameFundação para a Ciência e a Tecnologia
rcaap.rightsopenAccesspt_PT
rcaap.typedoctoralThesispt_PT
relation.isAuthorOfPublicationa04db523-c55d-4c9c-93a7-c62a20bfe4c7
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relation.isProjectOfPublicationf9adb2b7-cf40-4a7d-8b1b-128b7e138c4b
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thesis.degree.nameDoutoramento em Químicapt_PT

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