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Impacts of high pressure processing conditions on the microbiome of sea bass fillets
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Fish and seafood products are some of the most important protein sources in human nutrition and more than 45% of the fish used for human consumption comes from aquaculture. However, fish products are easily perishable and often associated with human diseases, leading to development of different preservation methods. Recently, novel processing techniques like High Pressure Processing (HPP), that uses pressure to inactivate microbes without heat, are being optimized to extend shelf-life without affecting food quality. We used metagenomics (the global study of genetic material from environmental or organism samples) to characterize in a global way the microbes present in sea bass fillets treated with different pressures (300-600 MPa) and processing times (2-5 min) and after refrigerated storage for 1 or 11 days, contributing to optimize HPP of these products. We extracted and selected 42 DNA samples (of 14 experimental groups) based on their quantity and quality and sent them to a sequencing company to construct microbiome libraries based on the 16S rRNA gene sequencing. With the sequencing and bioinformatics analysis using QIIME it was possible to evaluate the impacts of HPP treatments on the bacterial microbiome of the samples. There was a decrease in bacterial load in the treated samples when compared to the control (confirmed by quantitative PCR of 16S), which was especially evident when we compared the control at 11 days with the treated samples at 11 days, notably in the 450MPa and 600MPa treatments. The most abundant genera of bacteria in the control fillets significantly changed after storage for 11 days, leading to a different composition to 300 MPa fillets and separated by PCoA from 450-600 MPa fillets. These had a microbiome more similar to the initial control fillets. These results will help optimizing HPP of fish fillets and identifying the main genera of deterioration bacteria and HPP effects.
Peixes e mariscos são importantes fontes de proteína na nutrição humana. A produção de peixe aumentou ao longo dos anos, muito devido ao crescimento da aquacultura e o interesse por uma alimentação mais saudável. Atualmente mais de 45% dos peixes para consumo humano são provenientes da aquacultura e Portugal é o país mais relevante da UE em consumo per capita. No entanto os produtos alimentares à base de peixe (ricos em nutrientes e água) são facilmente deteoráveis e podem estar associados a doenças (difilobotríase), especialmente quando consumidos crus ou pouco cozinhados. Diversas técnicas de conservação têm sido utilizadas (ex. congelamento, defumação, salga). Atualmente a procura por produtos mais frescos e aumento de produção por aquacultura requer otimização de novas tecnologias de processamento para diminuir a deterioração alimentar (ex. alterações de cor, textura, cheiro ou sabor, frequentemente causada por microrganismos), estender o prazo de validade e a segurança (ex. intoxicações causadas pelos microrganismos e seus metabolitos) e diminuir o desperdício alimentar e perdas económicas (cerca de um terço da produção alimentar mundial é perdida todos os anos). Nesta tese, focámos na otimização do Processamento por Alta pressão (HPP) para preservação de filetes de robalo de aquacultura, pois é uma técnica promissora e em expansão de processamento alimentar não térmico, que aplica pressões entre 300MPa e 1000MPa durante vários minutos à temperatura ambiente para inativar microrganismos em alimentos sólidos ou líquidos. HPP tem sido aplicada a mariscos, frutas, molhos, carnes e vegetais, preservando a qualidade e sabor dos alimentos, mas aumentando a sua segurança e tempo de vida. Os parâmetros críticos são a pressão; os tempos para alcançar a pressão, de tratamento e de descompressão; as temperaturas iniciais do produto e durante tratamento e as características iniciais do produto (pH, composição nutricional e microbiológica, humidade) e o embalamento, pelo que a aplicação a novos produtos requer cuidada otimização para ser mais efetiva e ter menor custos de operação. Esta tese vem na continuação de trabalhos anteriores em que HPP melhorou a qualidade dos filetes de robalo, aumentou a sua vida útil e reduziu a carga microbiológica e proporção de géneros bacterianos de deterioração alimentar. No estudo atual, a metagenómica foi usada para estudar o microbioma presente nos filetes de robalo depois de aplicados diferentes tratamentos com o HPP (pressões de 300-600 MPa e tempos de 2-5 minutos) e tempos de armazenamento refrigerado (1-11 dias a 2ºC), para caracterizar globalmente os microrganismos nas amostras e o efeito de HPP e contribuir para a sua otimização. Os filetes sujeitos a estas condições experimentais foram fornecido por colaboradores na Grécia e no CCMAR procedeu-se à otimização e extração de DNA de amostras da sua superfície; controlo de qualidade por quantificação em espectrofotómetro Nanodrop e géis de eletroforese; seleção de amostras representativas (triplicados para 14 grupos experimentais) e envio para empresa de sequenciação (Laragen, USA) para produção de bibliotecas de microbioma, em que se usou o sequenciamento direcionado por PCR com o gene 16S rRNA como alvo. Este é o marcador taxonómico mais usado para bactérias, com zonas variáveis alternadas com conservadas, cobrindo a maioria das bactérias e boa disponibilidade em bases de dados. As bibliotecas foram analisadas usando o Qiime (com a base de dados SILVA e normalmente usado em metagenómica), em colaboração com parceiros no CCMAR. Às OTU (unidades taxonómicas operacionais, grupos de sequências identificados a um dado nível taxonómico) obtidas a partir da análise com conjunto de aplicações Qiime, foram retiradas as sequências identificadas como cloroplastos, sequencias não identificadas, singletons e doubletons (que apareceram menos de 3 vezes nas amostras) e os dados foram rarefeitos para o número mínimo de sequências obtidas nas bibliotecas. Produziram-se tabelas dos diferentes níveis taxonómicos e os cálculos da alfa diversidade (como Shannon Index e número de espécies identificadas). Identificaram-se assim os microrganismos mais abundantes ao nível do género e que poderão ser usados como potenciais marcadores para tratamentos específicos: Massilia, Carnobacterium, Shewanella e Janthinobacterium. O desenho de primers e testes para estes microrganismos mais abundantes estão a ser ainda desenvolvidos pelo que não serão inseridos nesta tese. Os resultados de culturas microbiológicas das amostras e testes sensoriais feitos pelos nossos colaboradores na Grécia (não incluídos nesta tese) apontam para uma diminuição da carga bacteriana das amostras sujeitas a pressões altas, mas pouca perda de qualidade, valores que no geral confirmam os obtidos no projeto piloto anterior (Tsironi et al. 2019). A aplicação de diferentes pressões levou a resultados muito semelhantes entre os diferentes grupos, com maior divergência no grupo 300MPa 11 dias que teve microbioma bastante diferente dos restantes a 11 dias (com o grande aumento de Carnobacterium). Nos outros grupos 450/600Mpa 11 dias houve uma diminuição de Massilia e um aumento de Shewanella, como no controlo, mas o microbioma a estas altas pressões foi mais semelhante ao do grupo controlo inicial. Resultados da diversidade com os valores de Shannon, observed_species e pelas curvas de rarefação (obtidas usando os ficheiros do Qiime com as OTUs após limpeza de dados e rarefação) confirmaram a diversidade dentro das amostras, que no global aumentou entre os 1 e 11 dias de armazenamento. O qPCR do 16S feito a maior número de amostras (n=5-7 por grupo) do que usado na sequenciação, pode confirmar que o controlo a 11 dias continha muita carga bacteriana, enquanto os tratamentos com 450MPa e 600MPa foram eficazes na redução do número de bactérias, contendo valores muito perto daqueles obtidos nas amostras com armazenamento de apenas 1 dia, e a pressão 300 MPa revelou valores intermédios. Os tratamentos com HPP com pressões de 450/600 MPa tanto em 2 mins como em 5 mins poderão ser eficazes para tratar este tipo de amostras, obtendo cargas e composições bacterianas aos 11 dias perto das do armazenamento inicial, e poderão contribuir para aumentar o seu tempo de vida útil. A pressão a 450 MPa poderá ser a melhor neste tipo de processamento de filetes por ser provável que cause menos danos físicos e sensoriais ao produto (ainda em estudo), tendo uma eficácia muito semelhante ao tratamento com 600Mpa, com menores gastos de energia.
Peixes e mariscos são importantes fontes de proteína na nutrição humana. A produção de peixe aumentou ao longo dos anos, muito devido ao crescimento da aquacultura e o interesse por uma alimentação mais saudável. Atualmente mais de 45% dos peixes para consumo humano são provenientes da aquacultura e Portugal é o país mais relevante da UE em consumo per capita. No entanto os produtos alimentares à base de peixe (ricos em nutrientes e água) são facilmente deteoráveis e podem estar associados a doenças (difilobotríase), especialmente quando consumidos crus ou pouco cozinhados. Diversas técnicas de conservação têm sido utilizadas (ex. congelamento, defumação, salga). Atualmente a procura por produtos mais frescos e aumento de produção por aquacultura requer otimização de novas tecnologias de processamento para diminuir a deterioração alimentar (ex. alterações de cor, textura, cheiro ou sabor, frequentemente causada por microrganismos), estender o prazo de validade e a segurança (ex. intoxicações causadas pelos microrganismos e seus metabolitos) e diminuir o desperdício alimentar e perdas económicas (cerca de um terço da produção alimentar mundial é perdida todos os anos). Nesta tese, focámos na otimização do Processamento por Alta pressão (HPP) para preservação de filetes de robalo de aquacultura, pois é uma técnica promissora e em expansão de processamento alimentar não térmico, que aplica pressões entre 300MPa e 1000MPa durante vários minutos à temperatura ambiente para inativar microrganismos em alimentos sólidos ou líquidos. HPP tem sido aplicada a mariscos, frutas, molhos, carnes e vegetais, preservando a qualidade e sabor dos alimentos, mas aumentando a sua segurança e tempo de vida. Os parâmetros críticos são a pressão; os tempos para alcançar a pressão, de tratamento e de descompressão; as temperaturas iniciais do produto e durante tratamento e as características iniciais do produto (pH, composição nutricional e microbiológica, humidade) e o embalamento, pelo que a aplicação a novos produtos requer cuidada otimização para ser mais efetiva e ter menor custos de operação. Esta tese vem na continuação de trabalhos anteriores em que HPP melhorou a qualidade dos filetes de robalo, aumentou a sua vida útil e reduziu a carga microbiológica e proporção de géneros bacterianos de deterioração alimentar. No estudo atual, a metagenómica foi usada para estudar o microbioma presente nos filetes de robalo depois de aplicados diferentes tratamentos com o HPP (pressões de 300-600 MPa e tempos de 2-5 minutos) e tempos de armazenamento refrigerado (1-11 dias a 2ºC), para caracterizar globalmente os microrganismos nas amostras e o efeito de HPP e contribuir para a sua otimização. Os filetes sujeitos a estas condições experimentais foram fornecido por colaboradores na Grécia e no CCMAR procedeu-se à otimização e extração de DNA de amostras da sua superfície; controlo de qualidade por quantificação em espectrofotómetro Nanodrop e géis de eletroforese; seleção de amostras representativas (triplicados para 14 grupos experimentais) e envio para empresa de sequenciação (Laragen, USA) para produção de bibliotecas de microbioma, em que se usou o sequenciamento direcionado por PCR com o gene 16S rRNA como alvo. Este é o marcador taxonómico mais usado para bactérias, com zonas variáveis alternadas com conservadas, cobrindo a maioria das bactérias e boa disponibilidade em bases de dados. As bibliotecas foram analisadas usando o Qiime (com a base de dados SILVA e normalmente usado em metagenómica), em colaboração com parceiros no CCMAR. Às OTU (unidades taxonómicas operacionais, grupos de sequências identificados a um dado nível taxonómico) obtidas a partir da análise com conjunto de aplicações Qiime, foram retiradas as sequências identificadas como cloroplastos, sequencias não identificadas, singletons e doubletons (que apareceram menos de 3 vezes nas amostras) e os dados foram rarefeitos para o número mínimo de sequências obtidas nas bibliotecas. Produziram-se tabelas dos diferentes níveis taxonómicos e os cálculos da alfa diversidade (como Shannon Index e número de espécies identificadas). Identificaram-se assim os microrganismos mais abundantes ao nível do género e que poderão ser usados como potenciais marcadores para tratamentos específicos: Massilia, Carnobacterium, Shewanella e Janthinobacterium. O desenho de primers e testes para estes microrganismos mais abundantes estão a ser ainda desenvolvidos pelo que não serão inseridos nesta tese. Os resultados de culturas microbiológicas das amostras e testes sensoriais feitos pelos nossos colaboradores na Grécia (não incluídos nesta tese) apontam para uma diminuição da carga bacteriana das amostras sujeitas a pressões altas, mas pouca perda de qualidade, valores que no geral confirmam os obtidos no projeto piloto anterior (Tsironi et al. 2019). A aplicação de diferentes pressões levou a resultados muito semelhantes entre os diferentes grupos, com maior divergência no grupo 300MPa 11 dias que teve microbioma bastante diferente dos restantes a 11 dias (com o grande aumento de Carnobacterium). Nos outros grupos 450/600Mpa 11 dias houve uma diminuição de Massilia e um aumento de Shewanella, como no controlo, mas o microbioma a estas altas pressões foi mais semelhante ao do grupo controlo inicial. Resultados da diversidade com os valores de Shannon, observed_species e pelas curvas de rarefação (obtidas usando os ficheiros do Qiime com as OTUs após limpeza de dados e rarefação) confirmaram a diversidade dentro das amostras, que no global aumentou entre os 1 e 11 dias de armazenamento. O qPCR do 16S feito a maior número de amostras (n=5-7 por grupo) do que usado na sequenciação, pode confirmar que o controlo a 11 dias continha muita carga bacteriana, enquanto os tratamentos com 450MPa e 600MPa foram eficazes na redução do número de bactérias, contendo valores muito perto daqueles obtidos nas amostras com armazenamento de apenas 1 dia, e a pressão 300 MPa revelou valores intermédios. Os tratamentos com HPP com pressões de 450/600 MPa tanto em 2 mins como em 5 mins poderão ser eficazes para tratar este tipo de amostras, obtendo cargas e composições bacterianas aos 11 dias perto das do armazenamento inicial, e poderão contribuir para aumentar o seu tempo de vida útil. A pressão a 450 MPa poderá ser a melhor neste tipo de processamento de filetes por ser provável que cause menos danos físicos e sensoriais ao produto (ainda em estudo), tendo uma eficácia muito semelhante ao tratamento com 600Mpa, com menores gastos de energia.
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Keywords
High pressure processing Metagenomics Spoilage Microorganisms Shelf life