Loading...
Publication
Evaluation of antimicrobial activity of indigenous wine yeasts
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.56 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Killer yeasts represent a very interesting part of microbiology, they are yeasts that can produce toxins that kill sensitive strains. They have various mechanisms of action such as: damaging the cell wall, permeabilising the cell membrane, disrupting the cell cycle and fragmenting RNA.
This phenotype was first described in Saccharomyces cerevisiae, but various studies have shown that it extends to several other yeast species, and they can be present in various ecosystems such as soil, plants, animals or vineyards.
Since killer yeasts are present in wine, indigenous yeasts from must have been studied for their antimicrobial capabilities, which could have various applications in terms of biocontrol, potential substitutes for commonly used antimicrobial agents.
Moreover, in the winemaking, these yeasts could be substitutes for sulphites, which are commonly used to inhibit spoilage yeasts like Pichia guilliermondii that can negatively affect the wine’s aroma, flavor, and mouthfeel.
This study focused on screening and identifying killer yeasts from wine must isolates. Mestchnikowia pulcherrima, a yeast with a killer phenotype, stood out among the isolates under study. It exhibits a killer phenotype not through conventional toxins but via a pigment known as pulcherrimin, which targets strains reliant on iron for survival.
It was possible to identify two proteins that are involved in the killer phenotype, the Ski3 and Ski8 proteins., that are part of a protein complex that promotes the degradation of mRNA, thus interfering with the cell cycle of sensitive microorganisms.
The results of this study highlight the potential of killer yeasts as new, natural antimicrobial agents that can be used to improve wine fermentation and preservation as well as protect wine from spoilage organisms. Furthermore, this research highlights their potential to treat pathogenic microorganisms, resistant to antimicrobial agents, suggesting a more natural, healthy, and sustainable strategy in the context of basic medicine.
As leveduras killer são uma parte muito cativante da microbiologia, estas leveduras têm a capacidade de produzir toxinas que têm como competências inibir ou matar estirpes de microrganismos sensíveis, não demonstrando citotoxicidade para as células animais. As toxinas killer apresentam vários mecanismos de ação, tais como: a) danificar a parede celular através da hidrólise de glucanos da parede celular ou inibição de β-1,3-glucano sintase; b) permeabilizar a membrana celular resultando na libertação de K+, H+, ATP, e outros metabolitos; c) perturbar o ciclo celular bloqueando a progressão do ciclo celular na fase G1/S ou a conclusão da fase G1; d) fragmentar o RNA em termos das subunidades 18S e 25S rRNA, ou tRNA. O fenótipo killer foi descrito pela primeira vez em Saccharomyces cerevisiae onde foram identificadas as toxinas killer K1, K2 e K28, posteriormente muitos estudos mostraram que este fenótipo se estende a várias outras espécies de leveduras tais como Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Hanseniaspora, Pichia, Torulaspora, Ustilago, Williopsis e Metschnikowia. Assim, essas leveduras podem ajudar a manter o equilíbrio em vários ecossistemas, como no solo, nas plantas, nos animais ou na vinha. Uma vez que as leveduras killer também estão presentes no vinho, as leveduras indígenas têm vindo a ser estudadas quanto às suas aplicações, como potenciais substitutos de agentes antimicrobianos ou biocontrolo natural. Estas leveduras apresentam potencial para substituir os agentes antimicrobianos sintéticos, e por isso podem ser utilizadas de forma a reduzir a resistência, que é um dos maiores problemas ao nível da saúde mundial. O biocontrolo natural está ligado com a inibição de crescimento de microrganismos deteriorantes em comida ou bebidas, tais como o vinho, de forma a reduzir o uso de conservantes químicos. Na indústria do vinho microrganismos como leveduras, fungos filamentosos e bactérias constituem um papel fundamental pois influenciam a saúde da vinha, na fermentação, sabor, cheiro e na qualidade final do vinho. Assim de forma a obter vinhos de alta qualidade tem sido cada vez mais proposta a utilização de leveduras indígenas, na substituição dos sulfitos. Os sulfitos são utilizados no tratamento do vinho para evitar a proliferação de leveduras de deterioração presentes no vinho, como a Pichia guilliermondii, que alteram as caraterísticas do vinho, assim as leveduras killer podem ser usadas para substituir estes conservantes químicos. A P. guilliermondii é uma levedura sensível a toxinas killer, frequentemente identificada como uma levedura de deterioração no contexto vinícola, notória por comprometer a qualidade do vinho. Esta levedura pode introduzir vários problemas durante a fermentação e o armazenamento do vinho, tais como gerar aromas estranhos e a alterar a cor e o sabor do vinho. Neste trabalho foram utilizadas leveduras isoladas, em estudos anteriores, a partir do mosto do vinho. Assim este estudo incidiu sobre o rastreio e na identificação de leveduras killer entre vários isolados de leveduras do mosto de vinho. Com esse objetivo foi necessário selecionar os isolados utilizando o meio YMA-MB, visto que este meio contém azul de metileno que penetra para o interior das células mortas, sendo possível a visualização de halos de inibição quando existe atividade killer. Apenas nove entre os sessenta isolados analisados apresentaram o fenótipo killer, sendo ainda possível separar os isolados em dois grupos: aqueles que provocaram halo de inibição e aqueles que provocaram halo de células mortas. Como controlo positivo foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae PYCC 4620, uma vez que esta levedura apresenta potencial killer contra a levedura Pichia guilliermondii. Depois da seleção dos isolados com perfil killer, as proteínas foram extraídas para análise por SDS-PAGE. A extração foi realizada através de um método mecânico que permitiu a separação das proteínas responsáveis pelo fenótipo killer dos restantes componentes celulares. Assim foi possível verificar que entre os isolados, as toxinas killer encontram-se em diferentes localizações celulares: no citoplasma, em que as leveduras apresentavam o fenótipo killer quando se testava o sobrenadante resultante do processo de extração proteico e no núcleo, em que este fenótipo se encontrava apenas quando se testava o extrato celular. Após a avaliação da atividade killer procedeu-se à identificação das leveduras killer por sequenciação do gene 18S rRNA. As leveduras com atividade killer no extrato celular foram identificadas como Mestchnikowia pulcherrima. Esta levedura destacou-se entre os isolados por apresentar os halos de inibição mais significativos. A levedura Mestchnikowia pulcherrima é considerada uma levedura com atividade antimicrobiana que não possui as toxinas killer, mas sim um pigmento de coloração vermelha que lhe confere esse fenótipo, o pulcherrimina. O pigmento pulcherrimina é responsável pela precipitação do ferro, tornando-o indisponível no meio, assim os microrganismos que dependem de ferro acabam por não sobreviver. Após a identificação dos isolados foi realizada a técnica de SDS-PAGE com o objetivo de separar as proteínas obtidas no extrato celular e realizar a técnica de zimografia. A zimografia permitiu a visualização do efeito killer em algumas frações proteicas. As frações proteicas que provocaram a inibição de crescimento de P. guilliermondii foram selecionadas e identificadas por MALDI-TOF/TOF. Os resultados foram inesperados, já que as frações correspondiam as enzimas fosfotransferase e transaldolase, que não têm qualquer ligação com a atividade killer, dado que a fosfotransferase é uma enzima responsável pela catalisação da transferência do grupo fosfato para um substrato específico, e, por outro lado, a enzima transaldolase está integrada na via metabólica das pentoses fosfato, responsável pela biossíntese de nucleótidos e ácidos nucleicos. Deste modo foi realizada a análise do proteoma completo, em que foi possível identificar duas proteínas que estão envolvidas no fenótipo killer, as proteínas Ski3 e Ski8. Estas proteínas superkiller fazem parte de um complexo proteico constituído por as proteínas Ski2, Ski3 e Ski8. O complexo Ski é responsável pela degradação do mRNA, interferindo assim no ciclo celular de microrganismos sensíveis. No entanto, estão reportadas evidências que mesmo na ausência de Ski2, o complexo formado pelas proteínas Ski3 e Ski8 é capaz de provocar o mesmo efeito. Na análise do proteoma não foram encontradas as proteínas responsáveis pela produção do pigmento pulcherrimina, o que pode significar que estas proteínas podem estar codificadas no citoplasma e assim estariam no sobrenadante e não no extrato celular. Uma vez que o sobrenadante da levedura Mestchnikowia pulcherrima não inibiu a levedura alvo Pichia guilliermondii, é possível que não haja a produção do pigmento pulcherrimina nas condições testadas e que apenas foi possível observar a ação das toxinas superkiller. Os resultados deste estudo realçam o potencial das leveduras killer como novos agentes antimicrobianos naturais que podem ser utilizados para melhorar a fermentação e a preservação do vinho, bem como para o proteger de organismos de deterioração. Além disso, esta investigação destaca o seu potencial para tratar microrganismos patogénicos, resistentes a agentes antimicrobianos, sugerindo uma estratégia mais natural, saudável e sustentável no contexto da medicina básica.
As leveduras killer são uma parte muito cativante da microbiologia, estas leveduras têm a capacidade de produzir toxinas que têm como competências inibir ou matar estirpes de microrganismos sensíveis, não demonstrando citotoxicidade para as células animais. As toxinas killer apresentam vários mecanismos de ação, tais como: a) danificar a parede celular através da hidrólise de glucanos da parede celular ou inibição de β-1,3-glucano sintase; b) permeabilizar a membrana celular resultando na libertação de K+, H+, ATP, e outros metabolitos; c) perturbar o ciclo celular bloqueando a progressão do ciclo celular na fase G1/S ou a conclusão da fase G1; d) fragmentar o RNA em termos das subunidades 18S e 25S rRNA, ou tRNA. O fenótipo killer foi descrito pela primeira vez em Saccharomyces cerevisiae onde foram identificadas as toxinas killer K1, K2 e K28, posteriormente muitos estudos mostraram que este fenótipo se estende a várias outras espécies de leveduras tais como Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Hanseniaspora, Pichia, Torulaspora, Ustilago, Williopsis e Metschnikowia. Assim, essas leveduras podem ajudar a manter o equilíbrio em vários ecossistemas, como no solo, nas plantas, nos animais ou na vinha. Uma vez que as leveduras killer também estão presentes no vinho, as leveduras indígenas têm vindo a ser estudadas quanto às suas aplicações, como potenciais substitutos de agentes antimicrobianos ou biocontrolo natural. Estas leveduras apresentam potencial para substituir os agentes antimicrobianos sintéticos, e por isso podem ser utilizadas de forma a reduzir a resistência, que é um dos maiores problemas ao nível da saúde mundial. O biocontrolo natural está ligado com a inibição de crescimento de microrganismos deteriorantes em comida ou bebidas, tais como o vinho, de forma a reduzir o uso de conservantes químicos. Na indústria do vinho microrganismos como leveduras, fungos filamentosos e bactérias constituem um papel fundamental pois influenciam a saúde da vinha, na fermentação, sabor, cheiro e na qualidade final do vinho. Assim de forma a obter vinhos de alta qualidade tem sido cada vez mais proposta a utilização de leveduras indígenas, na substituição dos sulfitos. Os sulfitos são utilizados no tratamento do vinho para evitar a proliferação de leveduras de deterioração presentes no vinho, como a Pichia guilliermondii, que alteram as caraterísticas do vinho, assim as leveduras killer podem ser usadas para substituir estes conservantes químicos. A P. guilliermondii é uma levedura sensível a toxinas killer, frequentemente identificada como uma levedura de deterioração no contexto vinícola, notória por comprometer a qualidade do vinho. Esta levedura pode introduzir vários problemas durante a fermentação e o armazenamento do vinho, tais como gerar aromas estranhos e a alterar a cor e o sabor do vinho. Neste trabalho foram utilizadas leveduras isoladas, em estudos anteriores, a partir do mosto do vinho. Assim este estudo incidiu sobre o rastreio e na identificação de leveduras killer entre vários isolados de leveduras do mosto de vinho. Com esse objetivo foi necessário selecionar os isolados utilizando o meio YMA-MB, visto que este meio contém azul de metileno que penetra para o interior das células mortas, sendo possível a visualização de halos de inibição quando existe atividade killer. Apenas nove entre os sessenta isolados analisados apresentaram o fenótipo killer, sendo ainda possível separar os isolados em dois grupos: aqueles que provocaram halo de inibição e aqueles que provocaram halo de células mortas. Como controlo positivo foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae PYCC 4620, uma vez que esta levedura apresenta potencial killer contra a levedura Pichia guilliermondii. Depois da seleção dos isolados com perfil killer, as proteínas foram extraídas para análise por SDS-PAGE. A extração foi realizada através de um método mecânico que permitiu a separação das proteínas responsáveis pelo fenótipo killer dos restantes componentes celulares. Assim foi possível verificar que entre os isolados, as toxinas killer encontram-se em diferentes localizações celulares: no citoplasma, em que as leveduras apresentavam o fenótipo killer quando se testava o sobrenadante resultante do processo de extração proteico e no núcleo, em que este fenótipo se encontrava apenas quando se testava o extrato celular. Após a avaliação da atividade killer procedeu-se à identificação das leveduras killer por sequenciação do gene 18S rRNA. As leveduras com atividade killer no extrato celular foram identificadas como Mestchnikowia pulcherrima. Esta levedura destacou-se entre os isolados por apresentar os halos de inibição mais significativos. A levedura Mestchnikowia pulcherrima é considerada uma levedura com atividade antimicrobiana que não possui as toxinas killer, mas sim um pigmento de coloração vermelha que lhe confere esse fenótipo, o pulcherrimina. O pigmento pulcherrimina é responsável pela precipitação do ferro, tornando-o indisponível no meio, assim os microrganismos que dependem de ferro acabam por não sobreviver. Após a identificação dos isolados foi realizada a técnica de SDS-PAGE com o objetivo de separar as proteínas obtidas no extrato celular e realizar a técnica de zimografia. A zimografia permitiu a visualização do efeito killer em algumas frações proteicas. As frações proteicas que provocaram a inibição de crescimento de P. guilliermondii foram selecionadas e identificadas por MALDI-TOF/TOF. Os resultados foram inesperados, já que as frações correspondiam as enzimas fosfotransferase e transaldolase, que não têm qualquer ligação com a atividade killer, dado que a fosfotransferase é uma enzima responsável pela catalisação da transferência do grupo fosfato para um substrato específico, e, por outro lado, a enzima transaldolase está integrada na via metabólica das pentoses fosfato, responsável pela biossíntese de nucleótidos e ácidos nucleicos. Deste modo foi realizada a análise do proteoma completo, em que foi possível identificar duas proteínas que estão envolvidas no fenótipo killer, as proteínas Ski3 e Ski8. Estas proteínas superkiller fazem parte de um complexo proteico constituído por as proteínas Ski2, Ski3 e Ski8. O complexo Ski é responsável pela degradação do mRNA, interferindo assim no ciclo celular de microrganismos sensíveis. No entanto, estão reportadas evidências que mesmo na ausência de Ski2, o complexo formado pelas proteínas Ski3 e Ski8 é capaz de provocar o mesmo efeito. Na análise do proteoma não foram encontradas as proteínas responsáveis pela produção do pigmento pulcherrimina, o que pode significar que estas proteínas podem estar codificadas no citoplasma e assim estariam no sobrenadante e não no extrato celular. Uma vez que o sobrenadante da levedura Mestchnikowia pulcherrima não inibiu a levedura alvo Pichia guilliermondii, é possível que não haja a produção do pigmento pulcherrimina nas condições testadas e que apenas foi possível observar a ação das toxinas superkiller. Os resultados deste estudo realçam o potencial das leveduras killer como novos agentes antimicrobianos naturais que podem ser utilizados para melhorar a fermentação e a preservação do vinho, bem como para o proteger de organismos de deterioração. Além disso, esta investigação destaca o seu potencial para tratar microrganismos patogénicos, resistentes a agentes antimicrobianos, sugerindo uma estratégia mais natural, saudável e sustentável no contexto da medicina básica.
Description
Keywords
Leveduras killer Toxinas killer Saccharomyces cerevisiae Pichia guilliermondii