Uma abordagem de matabolómica no estudo comparativo do metabolismo de glucose e galactose no patogénico humano Streptococcus pneumoniae

Maio, Maria Teresa

http://hdl.handle.net/10400.1/220

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Authors

Maio, Maria Teresa

Advisor(s)

Neves, Ana Rute

Ribeiro, Vera

Abstract(s)

O Streptococcus pneumoniae (ou pneumococos) é um organismo Gram-positivo e patogénico causador de doenças graves, tais como pneumonia, bacteremia e meningite e outras menos graves mas mais prevalentes tais como otites. O seu habitat natural são as mucosas da nasofarínge, onde co-existe com outra microbiota humana sem causar doença. A transição de organismo comensal a patogénico apenas ocorre quando os pneumococos invadem componentes normalmente estéreis das vias respiratórias. Durante esta progressão entre nichos ecológicos as bactérias são forçadas a adaptar-se às diferentes condições nutricionais encontrados em cada nicho. Entre os vários nutrientes, os açúcares têm um papel preponderante na fisiologia de pneumococos. Este microrganismo é estritamente fermentativo, gerando energia para crescer e se multiplicar durante a conversão de açúcares a piruvato através da via glicolítica. Posto isto, é mais do que razoável imaginar um papel importante dos açúcares na capacidade de S. pneumoniae causar doença invasiva. Este trabalho tem por objectivo estudar o metabolismo de dois açúcares, a glucose e a galactose, que se sabem estar presentes em dois dos nichos frequentados por S. pneumoniae, o sangue e a nasofarínge, respectivamente. A primeira tarefa consistia em obter o perfil de crescimento de pneumococos estirpe R6 em ambos os açúcares (1% m/v) num meio quimicamente definido. Contudo, e embora várias tentativas, não se conseguia obter perfis de crescimento reprodutíveis. Todas as culturas eram inoculadas com uma pré-cultura crescida durante a noite nas mesmas condições da cultura principal, e iniciadas pela adição de cultura stock da estirpe R6 guardada em glicerol a -80ºC. Uma caracterização detalhada da cinética do crescimento das pré-culturas permitiu concluir que a irreprodutibilidade observada nos crescimentos das culturas principais se devia principalmente ao facto de se utilizar como inóculo pré-culturas em fases distintas do crescimento. Uma vez identificado o problema, fixaram-se condições de preparação e recolha da pré-cultura (fase exponencial tardia) que permitiram então uma caracterização detalhada dos parâmetros de crescimento nos dois açúcares. Sumariamente, S. pneumoniae tem a capacidade de crescer quer em glucose quer em galactose como fontes únicas de energia, mas a glucose permite taxas de crescimento mais elevadas. Enquanto que o metabolismo da glucose é tipicamente do tipo homoláctico, a galactose induz um desvio metabólico a uma fermentação de ácidos iii mistos, com produção de formato, acetato e etanol além de lactato. Este padrão pode em parte explicar-se pela diminuição da actividade (cerca de 8 vezes) de desidrogenase do lactato, em células crescidas em galactose. Já a actividade de cinase do piruvato é idêntica nos dois açúcares. Uma análise completa do metabolismo não é possível sem determinar os conteúdos intracelulares em cada condição. A análise de metabolitos in vitro requer que a amostra utilizada para o efeito reflicta o estado metabólico de interesse. Para tal, a inactivação instantânea (quenching celular) do metabolismo é essencial. Quando a separação de metabolitos intracelulares e extracelulares é um requisito, é necessário garantir que o procedimento de quenching celular não afecte a integridade celular. Por outro lado, sabe-se que métodos de extracção apresentam desvantagens, tais como a degradação e a insolubilidade de metabolitos específicos. Para cada organismo, têm que se optimizar e validar métodos de quenching celular e extracção de metabolitos. Que nos estejamos conscientes, este procedimentos experimentais nunca foram aplicados a S. pneumoniae. Assim sendo, grande parte deste trabalho de tese consistiu em testar diferentes procedimentos de quenching celular (metanol a -20ºC, solução aquosa a 60% de metanol a -40ºC, 60% de metanol em solução de 0,85% de carbonato de amónio (pH 5,5) a -40ºC), bem como diferentes métodos de extracção (perclórica, etanólica a quente, e metanólica). Concluímos que as três soluções de quenching celular testadas afectaram a integridade celular resultando em perdas significativas de metabolitos; no que respeita aos tipos de extracção, a extracção perclórica revelou ser a mais promissora para estudos futuros. Tendo em conta estes resultados, testámos também um método em que os procedimentos de quenching celular e de extracção ocorrem num só passo, pela mistura rápida de uma solução fria de ácido perclórico com cultura celular. São apresentados resultados preliminares relativos a alguns metabolitos glicolíticos. Discute-se a necessidade de testar novos métodos e/ou optimizar os aqui já utilizados para quenching celular e/ou extracção de metabolitos em S. pneumoniae.