Development and improvement of gamete (cryo)preservation protocols for elasmobranchs

Magny, Ana

Publication

Development and improvement of gamete (cryo)preservation protocols for elasmobranchs

2024-12-13Master thesis

datacite.subject.fos	Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais
dc.contributor.advisor	Gallego, Víctor
dc.contributor.advisor	Velez, Zélia
dc.contributor.author	Magny, Ana
dc.date.accessioned	2025-07-30T12:44:34Z
dc.date.available	2025-07-30T12:44:34Z
dc.date.issued	2024-12-13
dc.description.abstract	Elasmobranchs are among the most threatened groups of vertebrates on Earth, and primary threats to their survival are overfishing and habitat destruction. To address this, both in-situ conservation efforts and ex-situ conservation programs are essential. Implementing assisted reproductive technologies, though not widely developed for elasmobranchs, is a crucial aspect of these ex-situ measures. This study aimed to improve the current gamete preservation protocols in elasmobranch using new storage conditions, new cryoprotectants, and new biodegradable vials. These trials used small-spotted catshark (Scyliorhinus canicula) as the model species, with sperm collected on the day of each experiment, and samples showing more than 70% motility were selected for the experiments. For the short-term storage trials, our data showed that the best short term storage method is at 4°C and pH 6.5, maintaining 40% motility for up to 14 days. About the study aimed at improving methods for "sending gamete samples", the best option was to store the sperm sample at room temperature with ice in it without cryoprotectants, achieving motilities close to 40-50% after 1 week. On the other hand, and regarding cryopreservation trials, the best result was obtained with the combination of 5% methanol and 5% DMSO, reaching post thawed motilities of 25-30%. In addition, biodegradable capsules were tested as an ecologic alternative to plastic vials in elasmobranchs, and first attempts showed that traditional vials, such us cryotubes, showed better results (30-35% of post-thawing motility) than biodegradable vials (15-20% after cryopreservation process). This study significantly advances gamete handling, evaluation, and cryopreservation protocols for elasmobranchs. Several objectives have been achieved, both by attempting to adapt and apply several reproductive techniques and tools previously used in other fish species, and by carrying out the current cryopreservation protocols developed on elasmobranch species.	eng
dc.description.abstract	Os elasmobrânquios estão entre os grupos de vertebrados mais ameaçados da Terra e as principais ameaças à sua sobrevivência são a sobrepesca e a destruição do habitat. Para fazer face a esta situação, são essenciais tanto os esforços de conservação in-situ como os programas de conservação ex-situ. Para garantir a conservação efetiva dos elasmobrânquios, é essencial compreender os diferentes fatores que influenciam o sucesso da reprodução assistida. Embora a tecnologia para criopreservação de esperma tenha avançado consideravelmente em outras espécies aquáticas, os elasmobrânquios apresentam desafios únicos devido à sua biologia reprodutiva distinta e à complexidade dos seus espermatozoides. A baixa disponibilidade de dados e de estudos relacionados a estas espécies reforça a importância de pesquisas contínuas, que visam otimizar técnicas de reprodução assistida e, em última análise, garantir a preservação de populações. Por tanto, este estudo teve como objetivo melhorar os actuais protocolos de preservação de gâmetas de elasmobrânquios, utilizando novas condições de armazenamento, novos crioprotectores e novos frascos biodegradáveis. A espécie modelo utilizada nestes ensaios foi o pata-roxa de manchas pequenas (Scyliorhinus canicula), que é uma espécie frequentemente utilizada como organismo modelo para os elasmobrânquios. Esta especie pode ser regularmente encontrados como parte do bycatch da pesca, onde alguns animais foram recolhidos e transportados para as instalações de aquicultura da Universitat Politècnica de València (UPV). Os animais são mantidos separadamente em seis tanques IRTAMAR de 500L com água do mar em recirculação (temperatura: 16-18 °C; salinidade: 38 ‰). Eles são alimentados uma vez por dia com arenques, lulas e algumas vitaminas. O esperma foi recolhido no dia da experiência e foi diluído 1:10 para avaliar a sua qualidade incial. Para os ensaios de armazenamento de curto prazo, foram testados dois pHs diferentes (6.5 e 7.8) e duas temperaturas diferentes (4 e 20 °C). As amostras foram observadas com um microscópioe os vídeos de cada amostra foram depois analisados manualmente, tendo si do registada a percentagem de espermatozóides móveis. Em geral, os dados mostraram que o melhor método para armazenar espermatozóides por um período de curto prazo é manter as amostras a 4°C em pH de 6,5, sendo possível atingir 40% de motilidade até 14 dias de armazenamento. Em contrapartida, as amostras incubadas a 20 °C mostraram diferenças estatísticas em relação ao grupo de controlo ao fim de 1 dia de armazenamento (motilidade de 50-55%, independentemente do pH). Além disso, a motilidade dos espermatozóides era inferior a 10% aos 3 dias de armazenamento a esta temperatura de incubação. As amostras de esperma armazenadas a 4 °C não mostraram diferenças estatísticas em relação ao grupo de controlo (dia 0) até ao tempo de armazenamento de 3 dias, mostrando valores entre 55-60% em ambos pHs. A partir desse ponto, a motilidade das amostras de esperma armazenadas a 4 °C diminuiu para 45-50% após 7 dias, e para menos de 40% após 14 dias (sem diferenças significativas entre pHs). Por outro lado, e relativamente ao estudo que visava melhorar os métodos de “transporte de gâmetas”, a melhor opção foi armazenar a amostra de esperma à temperatura ambiente com gelo no seu interior sem crioprotectores, conseguindo motilidades próximas de 40-50% após 1 semana. Em relação à criopreservação, os gametas tambem foram recolhido no dia da experiência, tendo sido selecionadas para as experiências amostras com mais de 60% de motilidade. No primeiro ensaio, utilizámos uma série de combinações diferentes de crioprotectores (metanol, MET; dimetil-sulfóxido, DMSO; glicerol, GLY; e etileno-glicol, ETG) e duas concentrações finais (10 e 20%) de acordo com 6 protocolos diferentes: MD-10: 5% MET + 5% DMSO; MD-20: 10% MET + 10% DMSO; GLY-10: 10% GLY; GLY-20: 20% GLY; ETG-10: 10% ETG; e ETG-20: 20% ETG. As amostras de esperma foram observadas antes e depois da criopreservação utilizando um microscópio, e uma câmara de video da amostra foram depois analisados manualmente. Em geral, os resultados mostraram que as amostras pós-descongelamento apresentaram valores de motilidade significativamente mais baixos do que as amostras frescas (que tinham cerca de 60-65%). Os melhores resultados foram obtidos pela combinação MD-10, com 25-30% de espermatozóides móveis pós-descongelamento, seguida pela combinação MD-20, com valores de motilidade pós-descongelamento de 20-25%. Por outro lado, os outros crioprotectores (GLY e ETG) não produziram bons resultados, provavelmente devido à elevada toxicidade destes crioprotectores. Isto foi mais pronunciado na utilização de GLY, quando a amostra de esperma imediatamente antes do processo de criopreservação (após o tempo de incubação), mostrou uma diminuição dramática de 60 a 30% durante um período de 15 minutos. Para o processo de criopreservação, foram testados dois crioviais diferentes: criotubos de 2 ml (CT) e cápsulas biodegradáveis de 1 ml (BC). A motilidade dos espermatozóides foi avaliada tambem antes e depois do processo de criopreservação. As amostras criopreservadas apresentaram valores de motilidade pós-descongelamento significativamente mais baixos do que as amostras frescas (que tinham cerca de 60-70%). No entanto, encontrámos diferenças entre os diferentes crioviais testados: O CT apresentou melhores valores de motilidade pós-descongelamento (30-35%) do que o BC (15-20%). Outros estudos que utilizem estes recipientes biodegradáveis devem abordar o tema das taxas de congelação, o que poderia melhorar a motilidade final dos gâmetas. No entanto, a nossa investigação pode potencialmente ajudar no desenvolvimento de projectos de inseminação artificial em elasmobrânquios, nos quais estas cápsulas biodegradáveis poderiam ser introduzidas nas fêmeas para obter sucesso na fertilização. Em conclusão, este estudo contribui significativamente para o avanço do conhecimento na área de preservação de gametos de elasmobrânquios, oferecendo novas perceções sobre os melhores métodos de armazenamento e as potenciais melhorias tecnológicas que podem ser implementadas para aumentar a viabilidade das populações em cativeiro. A implementação dessas tecnologias, juntamente com a continuidade das pesquisas e a aplicação de práticas de conservação sustentáveis, é essencial para garantir a sobrevivência de espécies de elasmobrânquios ameaçadas e para preservar a integridade dos ecossistemas marinhos que dependem delas.	por
dc.description.sponsorship	The project was funded by the Spanish Ministry of Science and Innovation (PID2022-138847-100 funded by MICIU/AEI/10.13039/501100011033 and ERDF/EU).
dc.identifier.tid	203945530
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.1/27516
dc.language.iso	eng
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject	Tubarões
dc.subject	Esperma
dc.subject	Criobanco
dc.subject	Reprodução
dc.subject	Criobiologia
dc.title	Development and improvement of gamete (cryo)preservation protocols for elasmobranchs	eng
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
thesis.degree.grantor	Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia
thesis.degree.level	Mestre
thesis.degree.name	Mestrado em Aquacultura e Pescas