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Percorrer FCB1-Teses por Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS) "10:Reduzir as Desigualdades"
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- Analysis of mutational allelic imbalances’ Influence on drug treatment responsePublication . Fontes, Melissa Ferreira; Maia, Ana-Teresa; Ferreira, Bibiana I.Breast cancer exhibits significant heterogeneity across various dimensions concerning histological and molecular classification, as well as mutational profile and clinical outcome. Defining treatment courses is likewise a complex task, as patients share similar features but different clinical prognoses. Nowadays, prognostic assessment tries to capture the morphologic and genetic variation within breast tumours, employing a variety of multigene molecular tests focusing on measuring gene expression of a specific gene panel, to predict patient outcome. In current clinical practice, the assessment of the PIK3CA mutational status is a routine procedure for hormone-receptor positive, HER2 negative metastatic breast cancers. Evaluation of gain-of-function mutations in the PIK3CA gene within this patient cohort helps to identify individuals who may benefit from systemic treatment with alpelisib, a PI3Kα-specific inhibitor. Previous studies have demonstrated that widespread allelic imbalances in the expression of somatic mutations in PIK3CA are associated with prognosis in breast cancer. Particularly, preferential expression of PIK3CA’s mutated allele is associated with poorer prognosis. Here, we hypothesise that differential allelic expression of PIK3CA mutations influences protein levels in breast cancer cells, thereby potentially affecting drug treatment response. We aimed to create an inducible PIK3CA breast cell-based tool capable of inducing different levels of PIK3CA mutational expressions as a platform to evaluate the impact of mutational expression levels on the response to PI3K-targeted therapies. Our goal was to create a cell-based system to precisely identify patients eligible for PI3K-α inhibitor therapies by modelling PIK3CA mutant expression dosages and assessing cell drug response. Our results show that we successfully generated a plasmid capable of constitutively expressing the wild-type isoform of the PIK3CA gene and also three inducible plasmids that can express three different levels of each PIK3CA mutant in a controlled manner. These plasmids constitute the tools required to transfect breast cell lines and generate the PIK3CA inducible system. Once the system is not yet created, our hypothesis is still subject to proof.
- Characterization of the role of H2S in neuronal differentiation in Trisomy 21Publication . Marques, Vera; Araújo, Inês; Simão, SóniaDown syndrome (DS) is caused by trisomy of chromosome 21 and is one of the most prevalent aneuploidies compatible with life. The characteristics of DS include congenital heart defects, craniofacial abnormalities, gastrointestinal anomalies, leukemia, seizures, early onset of Alzheimer´s disease, and cognitive impairment among others. Disturbances in the neurological signal processing during critical stages of neurogenesis can affect proliferation, migration, and differentiation of stem cells which may be responsible for the mental impairment of these individuals. These features are important to understanding how DS's brain development is affected. The gene coding for cystathionine-beta-synthase (CBS) is present in chromosome 21 with an extra copy in individuals with DS. CBS is one of the enzymes responsible for the cellular production of hydrogen sulfide (H2S). This is a ubiquitous small gaseous signaling molecule that plays an important role in many physiological processes. However, the contribution of H2S to the abnormal neurodevelopment of DS individuals has not been addressed and is currently under investigation under the Araújo lab. In this study, we aimed to evaluate the contribution of H2S in DS fibroblasts prior to reprogramming these cells into induced pluripotent stem cells (iPSC) to be used in the future as a human cellular model to address the role of H2S in neuronal differentiation in DS. To accomplish this objective, fibroblasts collected from Down Syndrome patients and healthy donors were obtained and H2S production was assessed by time-lapse imaging using a fluorescent probe selective for H2S. The fibroblasts were afterward reprogrammed into iPS cells. The levels of intracellular H2S were higher in the DS cell line when compared to the healthy donor cell line. iPS cells from the DS individuals and the healthy donor fibroblasts were reprogrammed with success and both cell lines expressed the main pluripotency markers Sox2, Nanog, and Oct4 observed by immunocytochemistry and flow cytometry analysis. The data obtained in this work and the iPS lines developed will allow in the future the establishment of an important cellular model to study how H2S affects neurodevelopment in DS.
- Characterization of TYK2 role in IL-7/IL-7R signaling in T-cell Acute Lymphoblastic LeukemiaPublication . Cavaco, Joana Margarida Bartolomeu; Fragoso, Ana Rita; Tavares, ÁlvaroA leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica que pode ser subdividida de acordo com o tipo de linfócitos afetados. Assim sendo, denomina-se leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T), quando existe a expansão e proliferação de linfócitos T imaturos, e leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B), quando associada à proliferação de linfócitos B imaturos. A LLA é o cancro pediátrico mais comum, sendo que dentro destes casos, aproximadamente 15% são de LLA-T. Após tratamento, 85% das crianças com LLA-T atingem remissão. No entanto, nos adultos esta percentagem é mais reduzida, ficando entre os 20-40%. O tratamento da LLA-T consiste num programa intenso de quimioterapia, que está associado a vários efeitos secundários. Para além disso, apesar destes doentes terem um prognóstico favorável à data do diagnóstico, a taxa de recidiva é elevada e está associada a um pior prognóstico, uma vez que a doença persistente é geralmente resistente à quimioterapia. Como tal, os efeitos secundários associados à quimioterapia e a falta de tratamento alternativos após recidiva realça a necessidade urgente da descoberta de novas abordagens terapêuticas. Este tipo de leucemia (LLA-T) está associada a diversas alterações genéticas, que resultam na desregulação do processo de desenvolvimento de células T, e por sua vez, levam à proliferação não controlada de células imaturas. A via de sinalização da interleucina-7 (IL-7) desempenha um papel muito importante no processo de diferenciação das células T. Estudos realizados demonstram que a eliminação desta via resulta no bloqueio do desenvolvimento de linfócitos T e B, e consequentemente na produção de linfócitos T não funcionais e numa população de linfócitos B reduzida. A ativação desta via requer a participação da IL-7 e do seu recetor, o IL-7R. O recetor da IL-7 é composto por duas subunidades, nomeadamente a cadeia a (IL-7Ra) e a cadeia g comum. Estas subunidades não possuem atividade catalítica intrínseca e como tal, para poderem fosforilar substratos e darem início à transdução de sinal necessitam da ação de outras proteínas, como as cinases Janus (JAK) JAK1 e JAK3, que se ligam à cadeia IL-7Ra e à cadeia g comum, respetivamente. Quando a interleucina se liga ao recetor, JAK1 e JAK3 fosforilam-se mutuamente, causando a sua ativação, o que resulta na fosforilação de tirosinas presentes nas cadeias do recetor, criando locais de ancoragem para a proteína STAT5. Esta proteína, ao ser ativada por JAK1 e JAK3, sofre dimerização e é transportada para o núcleo onde, atuando como um fator de transcrição, dá início à transcrição de genes envolvidos na proliferação, diferenciação e apoptose. (...)
- Development of novel nanoplatforms for the imaging and targeting of breast tumour microenvironmentPublication . Pereira, Mariana Franco; Maia, Ana Teresa; Mendes, BárbaraBreast cancer is the most diagnosed neoplasia in the world and affects millions of women each year. Despite being the type of cancer with the greatest selectivity of treatments, these lead to a wide range of side effects. Gene therapy has emerged as a new therapeutic approach for the treatment of various diseases. This therapy involves transferring genes or regulatory sequences into target cells. This can modify or inhibit the gene expression, improving the treatment of hereditary or acquired diseases. In this work polymeric nanoparticles were developed due to their excellent properties, including the ability to protect genetic material from degradation by nuclease, low toxicity, biocompatibility, biodegradability, and high stability. Polyplexes were produced and characterized as a subclass of polymeric nanoparticles, regarding their physicochemical properties (size, polydispersity index and surface charge), cell viability and transfection efficiency in 2D and 3D cell cultures. Polyplexes when complexed with nucleic acids (pDNA and pDNA-miR-125b) had a small size and positive surface charge at N/P ratio of 20. Regarding complexation with miR-125b, there is the formation of large nanoparticles in the same ratio. The cell viability analysis showed that the polyplexes were not toxic. Transfection assays demonstrated that polyplexes are more efficient at delivering miR-125b to BC cells in 2D. Transfection efficiency was highest in the MDA-MB-231 cells with 88% of transfection. The results of the expression of miR-125b showed a transient increase in its expression levels, contributing to the inhibition of proliferation and cell migration of BC cells. The results of the incubation of the polyplexes in the breast cancer spheroids showed low transfection efficiency, which can be related to the morphology of the spheroids. In conclusion, the S2 polyplexes proved to be an excellent nanoparticle for delivering miR-125b in breast cancer cells, representing a new potential therapeutic agent. Future testing on 3D spheroid models can include using PAMAM nanoparticles as the delivery system or improving the functionalization of S2 polyplexes to increase transfection efficiency and, consequently, the expression levels of miR-125b.
- Genetic diversity of rotavirus A causing diarrhea in patients admitted to the Clinic University Hospital in Valencia, Spain (2022-2024)Publication . Conjo, Carolina da Glória Dinis; Ferreira, Bibiana I.; Gomez, Javier Buesa; Deus, Nilsa deA diarreia é uma das principais causas de mortalidade infantil em todo o mundo, e o rotavírus destaca-se como o principal agente etiológico associado. Neste contexto, muitos países introduziram a vacina contra o rotavírus no seu calendário de vacinação infantil, incluindo a Espanha. No entanto, a carga das doenças diarreicas continua elevada. Existe uma lacuna de informação em relação a infecção por rotavírus em pacientes que não tenham idade pediátrica e muitos fatores podem estar implicados na suscetibilidade a infeção por rotavírus entre eles os fatores genéticos do hospedeiro denominados Histo Blood Group Antigens (HBGA´s), que podem reconhecer agentes entéricos que modulam doenças entéricas infecciosas, conferindo risco ou suscetibilidade à população. Foi realizada uma análise transversal de dados de base hospitalar, de abril de 2022 a fevereiro de 2024, em 136 pacientes atendidos com diarreia no Hospital Clínico Universitário de Valência. A triagem inicial das amostras foi feita por Real-Time PCR no Hospital Clínico Universitário de Valencia, 136 amostras foram positivas para Rotavírus A (RVA) e testadas por RT-PCR para a identificação do genótipo no laboratório de Microbiologia da Universidade de Valência. A maior diversidade de estirpes de rotavírus foi encontrada em crianças menores de 2 anos e os genótipos mais comuns nesta faixa etária foram G4P[8] e G12P[8]. Cerca de 26,5% das amostras eram não tipificáveis, 16,9% correspondiam a G4P[8], 16,2% eram NTP[8] e 11,8% eram G12P[8]. A sazonalidade foi associada à distribuição das estirpes de rotavírus (p-valor<0,001), com maior pico de infecção em maio, julho e abril de 2023. O status secretor do gene FUT2 foi determinado em 7,7% (2/26) das amostras testadas. A presente análise mostrou uma alta proporção de infecção e diversidade genotípica em crianças com menos de 24 meses de idade. No futuro, será necessário investigar a diversidade genética e a dinâmica evolutiva das estirpes de rotavírus. Embora o estudo tenha encontrado dificuldades na determinação do status secretor para FUT2 a partir das amostras fecais, apresentou informações inovadoras sobre o potencial e as limitações desta abordagem.
- Modelling left ventricular noncompaction cardiomyopathy in cardioidsPublication . Correia, Cátia Dias; Calado, Sofia; Bragança, JoséCongenital heart defects are the most common deficiency in new-borns. Specifically, a failure during myocardial compaction can lead to excessive trabeculation and intertrabecular recesses seen in left ventricular noncompaction (LVNC). Due to heterogeneity found in patients, more in-depth molecular research, with better disease models, is necessary to identify underlying genetic pathways and pathogenesis. Here, a novel self-assembling human cardioid differentiation protocol was used. Initially, three concentrations of a canonical Wnt pathway activator were tested, and addition of ascorbic acid. A higher concentration led to a full loss of organoids, while ascorbic acid slightly increased the number of organoids discarded but increased the number of beating control-derived organoids. Lastly, with hiPSCs established from LVNC patients, and a healthy relative, three initial seeding densities were tested. We experienced a high degree of heterogeneity in size and morphology, vascularisation formation, number of beating and discarded cardioids. We also analysed organoid circularity at two different stages of differentiation, but no conclusions can be made due to result variability and inconsistency between both cell lines, and/in all seeding conditions presenting no clear pattern. We also experienced a lack of fluorescence signal or a low antibody penetrability after immunofluorescence staining, and increased all incubation periods but still experienced a lack of signal for cardiomyocytes. Then, due to organoid size and density, we observed a low reachable sample depth during fluorescence microscopy. An additional step of ScaleA2 optical clearing was tested, which showed that a 10 day incubation period is crucial for imaging quality and reachable depth improvement. In conclusion, this is a promising but very demanding protocol that has to be thoroughly followed, with many influencing factors. More work is still necessary to improve its efficiency for further studies to determine their cardiac development capacity, and if it can be used to model LVNC in the future.
- Molecular tools to study SCA2: from new advanced disease models to CRISPR-mediated editing approachesPublication . Gonçalves, Rebekah Cavaco Koppenol; Nóbrega, Clévio; Matos, Carlos A.; Almeida, Luís Pereira deSpinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a rare neurodegenerative disease caused by an abnormal expansion of the trinucleotide CAG in the coding region of ATXN2. This overexpanded CAG region is translated into an abnormally long tract of glutamines within the ATXN2 protein, which above 32 repetitions drives pathology. SCA2 comprehends a complex network of pathological mechanisms, progressively leading to neuronal dysfunction and cell death. As a result of the expanded ATXN2-mediated neurodegeneration, especially affecting the cerebellum and the brainstem, SCA2 patients suffer from several motor and non-motor signs and symptoms, with ataxia as the most frequent. Currently, there is no therapy capable of delaying or stopping disease progression, leading to the premature death of patients. Disease models have proven to be a valuable tool for the study of the pathological mechanisms underlying SCA2. In this work we develop a new transgenic mouse model for SCA2 with early motor and neuropathologic phenotype to study the role of the ATXN2 expanded protein in the pathogenesis of the disease. Additionally, we generated a SCA2 patient-derived iPSC line to serve as a platform to test new advanced therapeutic strategies. Taking advantage of the CRISPR toolbox to manipulate gene expression, we designed three CRISPRbased strategies targeting the ATXN2 gene: a CRISPR-Cas9 indel directing the nuclease activity of Cas9 to an early site of the ATXN2 gene; a CRISPRi using the dCas9-KRAB complex to hinder transcription; and a CRISPR-Cas9 excision directing Cas9 to two sites of the ATXN2 to excise the CAG region. We tested these strategies in the newly generated SCA2 patient-derived iPSC line, inducing its differentiation into mature neurons. The CRISPR strategies resulted in a decrease of the ATXN2 protein levels or the complete ablation of ATXN2 expression, preventing several pathological traits of SCA2. The tools developed in this project support the development of CRISPR-based disease-modifying strategies for SCA2, enlightening the action of ATXN2-mediated pathogenesis.
- Operacionalização da ferramenta do Norwegian General Practice-Nursing Home à realidade portuguesaPublication . Tomé, Daniela Katrine Gudmand; Leitão, Helena; Nascimento, TâniaA prescrição de Medicamentos Potencialmente Inapropriados (MPI) é uma preocupação crescente entre a população idosa institucionalizada, devido às suas características específicas e à elevada prevalência de uso inadequado de medicamentos. Em Portugal, não existe uma lista adaptada de MPI para esta população, o que motivou a adaptação dos critérios Norwegian General Practice Nursing Home criteria (NORGEP-NH) para a realidade nacional. O objetivo principal desta dissertação foi operacionalizar os critérios NORGEP-NH para idosos institucionalizados em Portugal, utilizando o Método Delphi com um painel de peritos composto por médicos, farmacêuticos e enfermeiros com experiência na gestão de cuidados a idosos. Os critérios foram avaliados quanto à sua relevância clínica numa escala de Likert de 0 (sem relevância clínica) a 10 (alta relevência clínica). O processo de consenso necessitou de apenas uma ronda online. A lista final, resultante do consenso, incluiu 35 critérios explícitos para o uso potencialmente inapropriado de medicamentos em lares de idosos, divididos em três secções: substâncias únicas, combinações e desprescrição. A adaptação dos critérios NORGEP-NH para Portugal mostrou-se relevante e ajustada ao contexto clínico dos idosos institucionalizados, o que facilitará a prática clínica diária dos profissionais de saúde em lares de idosos. Conclui-se que a operacionalização dos critérios NORGEP-NH para a realidade portuguesa é uma ferramenta valiosa para melhorar a segurança medicamentosa e otimizar os cuidados aos idosos institucionalizados, contribuindo para uma prática clínica mais informada e orientada para as necessidades específicas dos utentes.
- Revisão da medicação de idosos institucionalizados em estruturas residenciais para pessoas idosas no AlgarvePublication . Andrade, Amanda de Oliveira; Leitão, Helena Santos; Nascimento, TâniaO avanço da medicina e a melhoria dos cuidados de saúde possibilitam que os indivíduos vivam mais e com melhor qualidade de vida. O envelhecimento é um processo natural que conduz a alterações anatomofisiológicas e metabólicas que modificam a farmacocinética e farmacodinâmicas dos medicamentos num idoso. Além destas alterações, o avanço da idade diminui a autonomia e a perceção de autocuidado, sendo necessário recorrer a instituições de cuidados, como as Estruturas Residenciais para Pessoas Idosas (ERPI). A revisão da medicação é um processo eficaz que procura a otimização e gestão correta da medicação, além da identificação de problemas relacionados com uso de medicamentos, como interações medicamentosas e reações adversas. O principal objetivo deste trabalho foi a caracterização do perfil farmacoterapêutico, por meio da revisão da medicação, de idosos institucionalizados em ERPI, no Algarve. Foram analisados os perfis terapêuticos dos 96 pacientes, com média de idade de 86.57±7.86 anos. Os idosos utilizavam em média 9.13±4.15 medicamentos e mais de 90% eram polimedicados. A revisão terapêutica ainda revelou que mais de 44% dos pacientes apresentavam elevada complexidade farmacoterapêutica e 91.7% possuíam potenciais interações medicamentosas. Mais de 86% fazia uso de pelo menos um Medicamento Potencialmente Inapropriado, segundo a EU(7)-PIM List, sendo os medicamentos para o sistema nervoso central os mais utilizados. A população idosa institucionalizada possui inúmeros problemas de saúde e é tendencialmente polimedicada e com problemas relacionados à medicação. A revisão farmacoterapêutica é uma ferramenta completa que pode minimizar a ocorrência destes obstáculos, buscando melhorar a qualidade de vida dos pacientes, além de facilitar e potencializar o regime terapêutico.