Loading...
18 results
Search Results
Now showing 1 - 10 of 18
- Evaluation of pEPI-1 and pEPito expression systems for gene transfer to the retinaPublication . Calado, Sofia de Amaral Melo; Silva, GabrielaO objectivo de estudo do nosso laboratório é o desenvolvimento de vectores não virais para a terapia génica ocular. O principal objectivo da terapia génica é a introdução de material genético no interior das células. Em teoria, o veículo ideal para a terapia génica é aquele que consegue penetrar eficientemente a membrana celular e libertar o material genético, sem desencadear uma resposta imunológica agressiva.
- Generation of a human induced pluripotent stem cell line (UALGi001-A) from a patient with Left-Ventricular Noncompaction CardiomyopathyPublication . Calado, Sofia; Bento, Dina; Justino, David; Mendes-Silva, Leonardo; Marques, Nuno; Bragança, JoséLeft Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy (LVNC) is characterized by excessive trabeculation of the left ventricle. To date, mutations in more than 40 genes have been associated with LVNC, however the exact mechanisms underlying the disease remain unknown. Here, we describe an induced pluripotent stem cell (iPSC) line (UALGi001-A) from a LVNC patient (LVNC-iPSC) that does not present mutations in the genes most commonly associated with the disease (van Waning et al., 2019). The LVNC-iPSC exhibited full pluripotency and differentiation potential, and retained a normal karyotype after reprogramming. This in vitro cellular model will be useful to study the molecular, genetic and functional aspects of LVNC.
- Cationic polyene phospholipids as DNA carriers for ocular gene therapyPublication . Machado, Susana; Calado, Sofia; Bitoque, Diogo; Oliveira, Ana Vanessa; Øpstad, Christer L.; Zeeshan, Muhammad; Sliwka, Hans-Richard; Partali, Vassilia; Pungente, Michael D.; Silva, GabrielaRecent success in the treatment of congenital blindness demonstrates the potential of ocular gene therapy as a therapeutic approach. The eye is a good target due to its small size, minimal diffusion of therapeutic agent to the systemic circulation, and low immune and inflammatory responses. Currently, most approaches are based on viral vectors, but efforts continue towards the synthesis and evaluation of new nonviral carriers to improve nucleic acid delivery. Our objective is to evaluate the efficiency of novel cationic retinoic and carotenoic glycol phospholipids, designated C20-18, C20-20, and C30-20, to deliver DNA to human retinal pigmented epithelium (RPE) cells. Liposomes were produced by solvent evaporation of ethanolic mixtures of the polyene compounds and coformulated with 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) or cholesterol (Chol). Addition of DNA to the liposomes formed lipoplexes, which were characterized for binding, size, biocompatibility, and transgene efficiency. Lipoplex formulations of suitable size and biocompatibility were assayed for DNA delivery, both qualitatively and quantitatively, using RPE cells and a GFP-encoding plasmid. The retinoic lipoplex formulation with DOPE revealed a transfection efficiency comparable to the known lipid references 3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl]-cholesterol (DC-Chol) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EPC) and GeneJuice. The results demonstrate that cationic polyene phospholipids have potential as DNA carriers for ocular gene therapy.
- Generation and cardiac differentiation of a human induced pluripotent stem cell line UALGi002-A from a female patient with Left-Ventricular Noncompaction CardiomyopathyPublication . Calado, Sofia; Bento, Dina; Marques, Nuno; Bragança, JoséLeft Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy (LVNC) is characterized by abnormal number and prominence of trabeculations of the left ventricle of the heart. Although LVNC has been associated with mutations in several genes encoding for transcriptional regulators, ion channels, sarcomeric and mitochondrial proteins, approximately 60% of LVNC patients do not present these genetic alterations. Here, we describe an induced pluripotent stem cell (hiPSC) line (UALGi002-A) originated from a LVNC female patient (LVNC-hiPSC) who does not present any previously known mutations associated to LVNC. The LVNC-hiPSC exhibited full pluripotency and differentiation potential and retained a normal karyotype after reprogramming. Moreover, the LVNC-hiPSC differentiated into contracting cardiomyocytes. This cellular model will be useful to study the molecular, genetic and functional aspects of LVNC in vitro.
- Multifactorial approach to non-viral gene therapy: development of an efficient system for the retinaPublication . Calado, Sofia de Amaral Melo; Silva, Gabriela; Araújo, InêsA terapia génica é uma estratégia terapêutica que se caracteriza pela entrega de material genético a uma célula alvo. A terapia génica tem sido vastamente utilizada no combate a diversas doenças genéticas e adquiridas, tais como as doenças cardiovasculares, cancro e doenças oculares, entre outras. Devido às suas características únicas, como tamanho reduzido, relativo isolamento da circulação sistémica e fácil acessibilidade a diferentes tipos celulares e tecidos, o olho é considerado o órgão ideal para o desenvolvimento de estratégias de terapia génica. A Retinite Pigmentosa e a Retinopatia Diabética são exemplos de doenças oculares genéticas e adquiridas, respetivamente, que afetam a retina e conduzem a uma perda irreversível de visão. Apesar da sua etiologia ser diferente, ambas as patologias partilham o facto de, atualmente, não existir um tratamento eficaz, o que faz destas bons alvos para terapia génica. Atualmente, cerca de 80% das estratégias de terapia génica usadas para doenças oculares são baseadas na utilização de vírus como vetores de entrega do material genético. Apesar da sua eficácia, esta abordagem acarreta uma série de desvantagens, principalmente do ponto de vista de segurança a nível imunológico e mutagénico. Assim, os vetores não-virais aparecem como estratégia alternativa aos vetores virais, pela sua fácil utilização, ilimitada capacidade de empacotamento de genes e ausência de resposta imunitária. Porém, a sua aplicação clínica encontra-se limitada, não só pela sua reduzida eficiência de transfeção como pela expressão genética transiente conferida pelos, até agora utilizados, sistemas de expressão. Neste sentido, nas últimas décadas têm sido desenvolvidos sistemas de expressão baseados em plasmídeos de ADN, que visam uma expressão prolongada, como os minicírculos, os vetores MIDGE, os pFARs e os plasmídeos epissomais com capacidade de auto-replicação. Exemplos de plasmídeos com capacidade de autoreplicação são os pEPI-1 e pEPito. Nestes plasmídeos, a capacidade de autoreplicação é conferida pela presença de S/MARs (Scaffold/Matrix Attachment Regions) no corpo do plasmídeo. As S/MARs são sequências de ADN ricas em nucleótidos Adenina (A) e Timina (T) capazes de ancorar a cromatina à matriz nuclear. As S/MARs parecem estar envolvidas na destabilização e abertura da dupla hélice de ADN, sugerindo um envolvimento na replicação e expressão do mesmo, uma vez que a transição de cadeia dupla para cadeia simples é necessária para a replicação e transcrição genética. Além disso, vetores com S/MARs são capazes de prevenir o silenciamento epigenético, protegendo o transgene das sequências regulatórias adjacentes e da heterocromatinização, mantendo o vetor num estado transcricionalmente ativo e conferindo, assim, estabilidade mitótica. As S/MARs têm, também, a capacidade de mediar a associação da partícula episomal aos cromossomas metafásicos, permitindo, assim uma distribuição igualitária dos epissomas para as células filhas, após a mitose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma estratégia de terapia génica nãoviral para doenças da retina, recorrendo ao uso de sistemas de expressão epissomais com capacidade de auto-replicação (pEPito) e de um sistema de entrega eficaz (eletroporação), de modo a conseguir uma expressão prolongada dos genes terapêuticos. Experimentalmente é possível dividir este trabalho em três secções: i) identificação de genes com potencial terapêutico em patologias da retina, como RP e RD; ii) clonagem dos genes em questão em vectores epissomais, pEPito e iii) administração dos vetores desenvolvidos in vivo, na retina de ratinhos, utilizando eletroporação como método de entrega dos sistemas de expressão. Foi recentemente descrito em ratinhos que mutações no gene ATR (Ataxia telangiectasia and Rad3 related) induzem uma acumulação de pigmento na retina, com consequente degeneração dos fotorrecetores (bastonetes e cones), semelhante à que acontece em pacientes com Retinite Pigmentosa. Nos animais Wild-Type esta proteína está localizada nos cílios dos fotorrecetores. Nos mutantes, a presença da proteína mutada induz um encurtamento dos cílios, originando uma degeneração dos bastonetes e, posteriormente, dos cones. Neste contexto, tentámos investigar qual a função desta proteína na formação e alongamento dos cílios retinianos. Os nossos estudos in vitro demonstraram que esta proteína está associada ao centrossoma das células ciliadas. Nestas células, o centrossoma é o local onde o cílio se forma e por onde começa a alongar. A inibição de ATR (pela cafeína) originou uma diminuição da expressão proteica e, como consequência, verificou-se uma diminuição no comprimento dos cílios das células tratadas, demonstrando uma relação direta entre a expressão de ATR e a função ciliar. Assim, podemos inferir que mutações no gene ATR podem ser responsáveis por alguns dos casos de RP que não estão associados aos genes normalmente implicados na doença. A Retinopatia Diabética é uma das principais complicações da Diabetes Mellitus. É considerada uma doença das barreiras hematorretinianas, na qual a hiperglicemia e isquémia são as principais responsáveis pelo desequilíbrio entre os fatores pro- e antiangiogénicos que conduzem à neovascularização e consequente perda de visão. Neste estudo avaliámos os efeitos da hiperglicemia e isquémia na barreira hematorretiniana externa, in vitro, em culturas de células do epitélio pigmentar da retina, sujeitas a glicose elevada e in vivo, no epitélio pigmentar da retina de ratinhos diabéticos Ins2Akita. Os nossos resultados mostraram um aumento do transportador de glicose (GLUT1) nos nossos modelos diabéticos. Este aumento está associado, não só, a um aumento no número de transportadores na membrana das células do epitélio pigmentar da retina, como também a um aumento da sua atividade, aumentando o consumo de glicose. Este aumento no consumo de glicose induz uma diminuição na produção e secreção de factores anti-angiogénicos, como o PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) por estas células. Esta diminuição contribui para o desequilíbrio entre os fatores pro- e anti-angiogénicos, contribuindo assim para o desenvolvimento da neovascularização. Baseado nos resultados anteriores, decidimos clonar o gene PEDF no vetor de expressão pEPito e, através de injeção subretiniana, administrá-lo nas células do epitélio pigmentar da retina de ratinhos Ins2Akita. Os nossos resultados mostraram que os nossos vetores foram capazes de sobre-expressar PEDF até três meses após a injeção, em níveis semelhantes aos dos animais controlo (não diabéticos). Esta sobreexpressão foi associada a uma diminuição de marcadores inflamatórios e angiogénicos, associados à doença. Estes resultados mostram que a sobre-expressão de PEDF pode constituir uma nova estratégia para o tratamento da RD. Os nossos resultados indicam que esta abordagem baseada em sistemas de expressão com capacidade de auto-replicação e menos susceptíveis ao silenciamento epigenético, como os pEPito, aliada a um método de entrega de ADN eficaz, como a eletroporação, pode ultrapassar as limitações associadas à utilização de vetores virais, conferindo um padrão de expressão génica prolongado e mantendo um elevado perfil de segurança, consistindo assim numa alternativa eficaz para a terapia génica retiniana.
- Altered bone microarchitecture in a type 1 diabetes mouse model Ins2 (Akita)Publication . Pires De Carvalho, Filipe Ricardo; Calado, Sofia; Silva, Gabriela A.; Diogo, Gabriela S.; Moreira da Silva, Joana; Reis, Rui L.; Cancela, M. Leonor; Gavaia, PauloType 1 diabetes mellitus (T1DM) has been associated to several cartilage and bone alterations including growth retardation, increased fracture risk, and bone loss. To determine the effect of long term diabetes on bone we used adult and aging Ins2 Akita mice that developed T1DM around 3-4 weeks after birth. Both Ins2 Akita and wild-type (WT) mice were analyzed at 4, 6, and 12 months to assess bone parameters such as femur length, growth plate thickness and number of mature and preapoptotic chondrocytes. In addition, bone microarchitecture of the cortical and trabecular regions was measured by microcomputed tomography and gene expression of Adamst-5, Col2, Igf1, Runx2, Acp5, and Oc was quantified by quantitative real-time polymerase chain reaction. Ins2 Akita mice showed a decreased longitudinal growth of the femur that was related to decreased growth plate thickness, lower number of chondrocytes and to a higher number of preapoptotic cells. These changes were associated with higher expression of Adamst-5, suggesting higher cartilage degradation, and with low expression levels of Igf1 and Col2 that reflect the decreased growth ability of diabetic mice. Ins2 Akita bone morphology was characterized by low cortical bone area (Ct.Ar) but higher trabecular bone volume (BV/TV) and expression analysis showed a downregulation of bone markers Acp5, Oc, and Runx2. Serum levels of insulin and leptin were found to be reduced at all-time points Ins2 Akita . We suggest that Ins2 Akita mice bone phenotype is caused by lower bone formation and even lower bone resorption due to insulin deficiency and to a possible relation with low leptin signaling.
- pEPito-driven PEDF Expression Ameliorates Diabetic Retinopathy HallmarksPublication . Calado, Sofia M.; Diaz-Corrales, Francisco; Silva, Gabriela A.Diabetic retinopathy (DR) is one of the major complications of diabetes mellitus. It is characterized by retinal microvascular changes caused by chronic exposure to hyperglycemia, leading to low tissue oxygenation and ultimately to neovascularization. Laser photocoagulation and vitrectomy are the most efficient treatments for DR, but display severe side effects such as the destruction of the healthy retina. Another clinical approach uses antiangiogenic agents to prevent and delay progression of neovascularization, but these require recurrent local administrations that increase the possibility of retinal detachment, vitreous hemorrhage, and cataract formation. Studies in human diabetic retinas have revealed an imbalance between proangiogenic factors such as the vascular endothelial growth factor (VEGF) and antiangiogenic factors, such as pigment epithelial-derived factor (PEDF). This imbalance favors pathological angiogenesis contributing to DR, and can constitute a therapeutic target. Gene therapy was recently shown to be an adequate intervention for long-term treatment of several retinal pathologies. We have previously shown the newly engineered episomal vector pEPito to be able of sustained gene expression in the mouse retina. We here show that pEPito was able to overexpress PEDF for up to three months, both in in vitro cultures of human retinal pigment epithelial cells and in the retina of diabetic mice after a single subretinal injection. In vivo, in parallel with the increase in PEDF we observed a decrease in VEGF levels in injected compared with noninjected eyes and a significant effect on two hallmarks of DR: reduction of glucose transport (by glucose transporter GLUT1), and reduction of inflammation by decreased reactivity of microglia. Jointly, these results point to a significant therapeutic potential of gene therapy with pEPito-PEDF for the treatment of DR.
- Human-derived NLS enhance the gene transfer efficiency of chitosanPublication . Bitoque, Diogo; Morais, Joana; Oliveira, Ana; Sequeira, Raquel L.; Calado, Sofia; Fortunato, Tiago M.; Simão, Sónia; Rosa Da Costa, Ana; Silva, Gabriela A.Nuclear import is considered as one of the major limitations for non-viral gene delivery systems and the incorporation of nuclear localization signals (NLS) that mediate nuclear intake can be used as a strategy to enhance internalization of exogenous DNA. In this work, human-derived endogenous NLS peptides based on insulin growth factor binding proteins (IGFBP), namely IGFBP-3 and IGFBP-5, were tested for their ability to improve nuclear translocation of genetic material by non-viral vectors. Several strategies were tested to determine their effect on chitosan mediated transfection efficiency: co-administration with polyplexes, co-complexation at the time of polyplex formation, and covalent ligation to chitosan. Our results show that co-complexation and covalent ligation of the NLS peptide derived from IGFBP-3 to chitosan polyplexes yields a 2-fold increase in transfection efficiency, which was not observed for NLS peptide derived from IGFBP-5. These results indicate that the integration of IGFBP-NLS-3 peptides into polyplexes has potential as a strategy to enhance the efficiency of non-viral vectors.
- Human stem cells for cardiac disease modeling and preclinical and clinical applications—are we on the road to success?Publication . Correia, Cátia; Ferreira, Anita; Fernandes, Mónica T.; Silva, Bárbara M.; Esteves, Filipa; Leitao, Helena; Bragança, José; Calado, SofiaCardiovascular diseases (CVDs) are pointed out by the World Health Organization (WHO) as the leading cause of death, contributing to a significant and growing global health and economic burden. Despite advancements in clinical approaches, there is a critical need for innovative cardiovascular treatments to improve patient outcomes. Therapies based on adult stem cells (ASCs) and embryonic stem cells (ESCs) have emerged as promising strategies to regenerate damaged cardiac tissue and restore cardiac function. Moreover, the generation of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells has opened new avenues for disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine applications, with fewer ethical concerns than those associated with ESCs. Herein, we provide a state-of-the-art review on the application of human pluripotent stem cells in CVD research and clinics. We describe the types and sources of stem cells that have been tested in preclinical and clinical trials for the treatment of CVDs as well as the applications of pluripotent stem-cell-derived in vitro systems to mimic disease phenotypes. How human stem-cell-based in vitro systems can overcome the limitations of current toxicological studies is also discussed. Finally, the current state of clinical trials involving stem-cell-based approaches to treat CVDs are presented, and the strengths and weaknesses are critically discussed to assess whether researchers and clinicians are getting closer to success.
- Reprogramming iPSCs to study age-related diseases: models, therapeutics, and clinical trialsPublication . Esteves, Filipa; Brito, David; Rajado, Ana Teresa; Silva, Nádia; Apolónio, Joana; Roberto, Vania Palma; Araújo, Inês Maria; Nóbrega, Clévio; Castelo-Branco, Pedro; Bragança, José; P. Andrade, Raquel; M. Calado, Sofia; Faleiro, L; Matos, Carlos A; Marques, Nuno; Marreiros, Ana; Nzwalo, Hipólito; Pais, Sandra; Palmeirim, Isabel; S, Simão; Joaquim, Natércia; Miranda, Rui; Pêgas, António; Raposo, Daniela Marques; Sardo, AnaThe unprecedented rise in life expectancy observed in the last decades is leading to a global increase in the ageing population, and age-associated diseases became an increasing societal, economic, and medical burden. This has boosted major efforts in the scientific and medical research communities to develop and improve therapies to delay ageing and age-associated functional decline and diseases, and to expand health span. The establishment of induced pluripotent stem cells (iPSCs) by reprogramming human somatic cells has revolutionised the modelling and understanding of human diseases. iPSCs have a major advantage relative to other human pluripotent stem cells as their obtention does not require the destruction of embryos like embryonic stem cells do, and do not have a limited proliferation or differentiation potential as adult stem cells. Besides, iPSCs can be generated from somatic cells from healthy individuals or patients, which makes iPSC technology a promising approach to model and decipher the mechanisms underlying the ageing process and age-associated diseases, study drug effects, and develop new therapeutic approaches. This review discusses the advances made in the last decade using iPSC technology to study the most common age-associated diseases, including age-related macular degeneration (AMD), neurodegenerative and cardiovascular diseases, brain stroke, cancer, diabetes, and osteoarthritis.