Potential immunological biomarkers for gilthead seabream (Sparus aurata) welfare when exposed to an acute infection of amyloodinium ocellatum

Ribeiro, Gonçalo Lopes Leal

Publication

Potential immunological biomarkers for gilthead seabream (Sparus aurata) welfare when exposed to an acute infection of amyloodinium ocellatum

2023-11-29Master thesis

datacite.subject.fos	Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais
dc.contributor.advisor	Martins, Rute Sofia Tavares
dc.contributor.advisor	Marques, Cátia Andreia Lourenço
dc.contributor.author	Ribeiro, Gonçalo Lopes Leal
dc.date.accessioned	2024-07-10T09:58:50Z
dc.date.available	2024-07-10T09:58:50Z
dc.date.issued	2023-11-29
dc.description.abstract	O Amyloodinium. ocellatum é um ectoparasita obrigatório dinoflagelado que afeta muitas produções de aquacultura no sul da Europa. É uma preocupação central em aquacultura devido à sua capacidade para causar mortalidade súbita nos peixes, especialmente em produções semi-intensivas. A dourada (Sparus aurata) é uma das espécies em produção mais afetadas, e apesar de a sintomatologia e causas de mortalidade estarem bem descritas e documentadas, a reação fisiológica e imunológica do hospedeiro ao parasita ainda são pouco conhecidas. Além disso, os tratamentos existentes são pouco eficazes contra todos os estadios de vida do parasita, podem provocar stress no hospedeiro, e impossibilitar a venda e consumo destes animais. Neste estudo o objetivo foi clarificar os mecanismos moleculares da resposta fisiológica da dourada a infecções de A. ocellatum. De modo a identificar e selecionar candidatos a biomarcadores que possam ser usados para monitorizar o bem-estar e saúde dos peixes em aquacultura. De modo a alcançar este objetivo, foi desenhado um ensaio de infeção. Três tanques controlo e três tanques de infeção foram montados em sistema fechado com apenas arejamento. Estes tanques foram colocados numa sala termicamente isolada a 23ºC durante todo o ensaio. Quarenta e duas douradas juvenis foram divididas pelos 6 tanques (7 em cada). Água com uma concentração de 78x103/ml de A. ocellatum foi adicionada aos tanques de infeção. De modo a avaliar o progresso da infeção e o estado dos peixes, foram feitas 3 amostragens em três pontos temporais: 24h, 48h e 72h. Nestas, o primeiro e segundo arcos branquiais dos indivíduos foram removidos e observados ao microscópio numa amplitude de 40x. Três locais da branquia foram aleatoriamente escolhidos e o número de A. ocellatum foi contado. Em cada uma destas amostragens foi removido 1 peixe de cada tanque.. Na amostragem final todos os peixes n=30 foram sacrificados ebranquias, fígados, baços, e intestinos foram recolhidos e colocados a -80ºC, até serem processados. As branquias e baços de 6 indivíduos, 3 controlo e 3 infetados, foram sujeitas a uma análise via RT-qPCR. Seis genes candidatos a biomarcadores foram escolhidos (TNF- α, IL-1β, HIF1-α, Cox-2, PPAR-α, e IgM) e a sua expressão foi analisada. Nas branquias apenas o IgM e o HIF1-α foramsobre expressos, sendo a diferença estatisticamente significativa apenas para o IgM. IgM é uma imunoglobulina que é expressa em diversos tecidos e é essencial para proteção contra diferentes agentes patogénicos. HIF1-α é um biomarcador habitualmente utilizado em peixes para avaliar hipoxia aguda e crónica e em ambas estas condições se têm demonstrado haver uma sobreexpressão. Algumas da possíveis razões para uma falta de significância estatística podem ser o facto de ter sido analisado uma quantidade de amostras insuficiente, ou uma análise feita numa janela temporal incorreta, já que outros estudos feitos com este gene admitem que uma exposição prolongada a condições de hipoxia causa a sobreexpressão deste marcador. As duas citoquinas pro-inflamatórias estudadas estavam sub-expressas nos peixes infetados, apesar de não ter sido observada significância estatística. Este resultado não era esperado, mas a maior parte dos estudos com citoquinas parecem estar ligados a exposições crónicas e correlacionados com os danos observados nos tecidos. Assim, é possível que a exposição feita neste estudo não tenha sido suficientemente longa para provocar danos significativos e uma sobre expressão destes genes. A expressão do Cox-2 não foisignificativamente alterada, apesar de os peixes infetados parecerem ter níveis de expressão menores que peixes controlo. A expectativa inicial seria que houvesse um aumento dos níveis de mRNA de Cox-2 em indivíduos infetados. No entanto, estudos feitos com este gene apontam para resultados contraditórios que podem estar relacionados com uma aparente interligação entre os genes Cox-2, IL-1β e TNF-α. Finalmente, o PPAR-α apresentou-se tal como IL-1β, TNF-α e Cox-2, ligeiramente sub-expresso, no entato sem significância estatística. Neste caso, os resultados não são surpreendentes visto que este gene é predominantemente expresso no fígado e não nas branquias. Aliás em dourada o PPAR-γ aparenta ser mais expresso do que o PPAR-α, sugerindo a utilização do primeiro ofereça em estudos futuros para avaliar o potencial deste gene como biomarcador para o catabolismo de lípidos em resposta a uma infecção. A importância do baço durante infeções parasítárias tem sido descrita em muitos estudos como uma resposta sistémica a infeções secundarias e participação no processo de regeneração de feridas. Neste estudo não foram detetadas nenhumas diferenças significativas em nenhum dos genes analisados no baço de peixes infetados quando comparado com o controlo. No entanto, todos os genes (excepto Cox-2) aparentam estar ligeiramente sobre-expressos. Apesar disto, devido a grande variabilidade nos valores de expressão dos indivíduos infetados, nenhum apresentou diferenças estatísticas. No entanto, a aparente sobre-expressão dos genes analisados neste estudo estão de acordo com as nossas expectativas e com a literatura. Para oHIF1-α, por exemplo, já foi reportada uma ligeira sobre-expressã após 12 e 24h, e ainda uma sobre-expressão significativa aquando de uma exposição a longo prazo. Assim, tal como nas branquias, a janela temporal de exposição ao parasita parece ser um fator chave para detetar respostas imunitárias no hospedeiro. Isto pode explicar o porque de não ter disso detetada nenhuma resposta na expressão deste gene no baço. Contrariamente ao observado nas braquias, a sobre-expressão de IgM não foi estatísticamente. Isto pode dever-se ao facto de ter sido detetada uma grande variabilidade nos níveis de expressão genética entre os indivíduos infetados. Todavia, esta pequena sobre-expressão está de acordo com as expectativas, já que alguns estudos feitos com circunstâncias similares apontam para uma resposta imunológica sistémica mais tardia. Assim é possível hipotetizar que em 72h A. ocellatum ativa uma resposta imunológica relativamente forte no local de infeção, mas não uma resposta sistémica completa. Como dito anteriormente a expressão das citoquinas pro-inflamatórias no baço não foi estatisticamente significativa. Apesar disso notou-se uma ligeira sobre-expressão. A resposta destas citoquinas a infecções está bem descrita em peixes, e o tempo ao qual essa é activada pode variar de acordo com o estímulo e espécie estudada. Por isso a falta de significância revelada neste estudo pode indicar que se tivéssemos analisado as amostras noutra escala temporal poderíamos ter encontrado resultados similares as expectáveis. Tal como nas branquias Cox-2 não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre infectados e controlo. Isto pode ser explicado pela mesma razão que nas branquias. Por fim, a expressão de PPAR-α também se demonstrou estatisticamente insignificante, mesmo que tenha sido o gene com maior resposta. De qualquer forma, devido a alta variância nos níveis de expressão entre indivíduos do grupo de infectados estes resultados não podem ser conclusivos. Em conclusão este estudo focou-se nas respostas iniciais (72h) das branquias e baços de dourada a uma exposição aguda de A. ocellatum. Este apenas demonstrou uma resposta forte de IgM no local de infecção (branquias), e nenhuma resposta significante foi detectada nos baços. No entanto, devido ao facto de só termos analisado um n=3 dos grupos infectados e de controlo, é possível que alguns dos genes estejam de facto a responder ao parasita, mas a falta de amostras individuais não providencie poder estatístico suficiente para o detectar. Para estudos futuros um aumento do tamanho da amostra, pontos de amostragem antes e depois das 72h, analise de mais tecidos tais como fígado, intestino e sopra-renal, alteração da carga de parasitas, desenhar a experiência para uma exposição crónica em vez de aguda, e estudar novos genes candidatos; podem ser formas de obter mais e melhores resultados.	por
dc.description.abstract	A. ocellatum is an obligate ectoparasitic dinoflagellate that affects many aquaculture productions in southern Europe. It is considered a central concern in fish farming due to its ability to cause sudden mortality to the fish, especially in semi-intensive productions. Gilthead seabream is one of the fish species productions affected, and although the symptomology and mortality causes are well described and documented, the host physiological and immunological responses to the parasite are poorly understood. In addition, the treatments that exist are ineffective against all stages of the parasite’s life cycle and can induce stress on the host. In this study the objective was to clarify the molecular mechanisms underlying the seabream physiological response to A. ocellatum infestations hoping to pinpoint candidate biomarkers that may be used to monitor the fish welfare and health in production systems. In order to do so, seabream infected with an acute exposure to A. ocellatum were dissected 72h post initial infection and their gills and spleen analysed via RT-qPCR. Six candidate biomarkers were chosen: TNF-α, IL-1β, HIF1-α, Cox-2, PPAR-α, and IgM. In the gills IgM was the only to be up-regulated, which went in favour of our expectations. The rest did not present statistical significance. In the spleen no genes showed a statistically significant change in their expression. However, all, but Cox-2 seem to have a tendency to be up-regulated in the infected groups.	por
dc.identifier.tid	203497554
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.1/25581
dc.language.iso	eng
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject	amyloodinium ocellatumi
dc.subject	Dourada
dc.subject	Exposição aguda
dc.subject	Marcadores
dc.subject	Brânquias
dc.subject	Baço
dc.subject	Imunoglobulina m
dc.title	Potential immunological biomarkers for gilthead seabream (Sparus aurata) welfare when exposed to an acute infection of amyloodinium ocellatum	por
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
thesis.degree.grantor	Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia
thesis.degree.level	Mestre
thesis.degree.name	Mestrado em Aquacultura e Pescas