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Effect of EDTA enriched diets on farmed fish allergenicity; a proteomics approach
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
A continuously increase of the world’s population has been registered over the last
decades, along with an augment of fish consumption worldwide. Fish is one of the most
common elicitors of food-allergies. The panallergen in fish, β-parvalbumin (β-PV), is
responsible for the initiation of immunoglobulin-E (IgE)-mediated allergic reactions. PV is
a calcium-binding muscle protein, highly stable and IgE cross-reactive. Conserved IgE
epitopes are located in the calcium-binding domains where a reduced IgE-binding capacity
was found upon calcium depletion. The present work aims to reduce farmed fish
allergenicity by inducing this potentially less allergenic PV (apo-PV), through specific fish
diets supplemented with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), a calcium chelator used
as tool to deplete calcium-ions from PV. Gilthead sea bream (Sparus aurata) was reared
under four different conditions differing in the supplementation of EDTA. After 98 days of
trial, fish were slaughtered and muscle and plasma samples were taken. A biochemical
characterization was performed, along with a proteomic analysis. Fish extracts were
prepared from fish muscles and proteins were separated by two dimensional difference gel
electrophoresis (2D-DIGE) followed by spot identification using matrix-assisted laser
desorption ionization – time of flight/ time of flight mass spectrometry (MALDITOF/
TOF). Fish allergenicity was evaluated by skin-prick tests (SPT) and immunoblot
assays with sera from fish-allergic patients. Low concentrations of EDTA showed to have
a positive impact in reducing allergenicity without affecting fish growth performance and
organoleptic properties. Comparative proteomics showed an effect of the diets with 8% of
EDTA in the expression of several proteins with a variety of functions. As expected,
parvalbumin’s expression was unchanged. SPTs and immunoblot assays revealed a slightly
reduction of the allergenicity. This preliminary experiment shows that an EDTA
supplemented diet might be a promisor tool to modulate fish allergenicity and it is a
valuable contribution to improve safety of aquaculture fish.
Um crescimento contínuo da população tem sido registado ao longo das últimas décadas, acompanhado de um aumento do consumo de peixe a nível mundial. Este aumento do consumo de peixe, associado à promoção de hábitos alimentares que incita o consumo deste produto alimentar, e à diminuição dos stocks de peixes selvagens nos oceanos levou a uma maior procura de peixes de aquacultura. No entanto, o peixe é um dos principais instigadores de alergias alimentares e estudos que englobem as medidas de criação de peixe em aquacultura para modulação deste potencial alergénico são escassos ou praticamente inexistentes. As alergias alimentares são um problema em crescimento na sociedade atual e uma elevada prevalência das alergias a peixe tem sido registada principalmente em países costeiros e países onde o consumo de peixe é elevado. O principal alergéneo no peixe, designado por β-parvalbumina (β-PV), é responsável por desencadear reações alérgicas mediadas por anticorpos imunoglobulina-E (IgE). A PV é uma proteína do músculo, pequena (Mw ~12 kDa), acídica (pI ~ 6), que participa na contração e relaxamento muscular. Pertence à família designada por EF-hand, caracterizada por apresentar dois domínios EF-hand capazes de se ligarem a iões de cálcio. Assim, esta proteína é capaz de se ligar a dois iões cálcio ao mesmo tempo. A quantidade de PV varia também consoante o tipo de músculo e quantidades mais elevadas desta proteína têm sido associadas a uma maior rapidez de relaxamento muscular. É uma proteína altamente estável a desnaturação química, térmica, e proteolítica, e que apresenta reatividade cruzada com os anticorpos IgE. Esta reatividade cruzada é responsável pelo facto de grande parte dos pacientes alérgicos a peixes serem alérgicos a mais do que uma espécie diferente de peixe. Ou seja, estes domínios de ligação podem apresentar uma elevada homologia entre espécies. Na PV estes domínios proteicos onde se ligam os iões de cálcio apresentam epítopos, zonas onde se ligam os anticorpos IgE, que contêm regiões conservadas de aminoácidos. A capacidade de ligação dos IgE aos epítopos é reduzida aquando da libertação dos iões de cálcio da proteína uma vez que uma diferente conformação é induzida. Assim, o presente trabalho visa reduzir a alergenicidade do peixe de aquacultura induzindo uma forma da PV potencialmente menos alergénica (apo-PV), através de dietas suplementadas com ácido etilenodiaminotratraacético (EDTA). Este quelante de cálcio foi usado neste trabalho como uma ferramenta para diminuir a disponibilidade de cálcio no músculo ou mesmo para retirar os iões de cálcio da PV uma vez que foi provado já em diversos estudos, que o EDTA é capaz de imitar a PV na maioria das suas tarefas de contração/ relaxamento muscular. Doze grupos de douradas (Sparus aurata), constituídos por 25 peixes cada, foram submetidos a quatro condições de crescimento (três tanques para cada condição) diferindo na concentração de EDTA presente na dieta: controlo (0% de EDTA), EDTA3%, EDTA5% e EDTA8%. Após 98 dias de ensaio, os peixes foram abatidos em água e gelo e retiradas amostras de músculo e plasma. Foi realizada uma caracterização bioquímica do músculo do peixe onde foram avaliados os seguintes parâmetros como medidas de qualidade e bem-estar: pH, rigor mortis, capacidade de retenção de água do músculo (WHC), textura e análise sensorial. Foi feita também uma quantificação dos níveis sanguíneos de cortisol nos peixes de modo a poder avaliar-se o estado de stress a que os animais estavam submetidos. Seguiu-se uma quantificação da PV através do método de imunodetecção ELISA. Este método foi validado com uma análise proteómica uma vez que os métodos ELISA disponíveis no mercado apresentam anticorpos contra a parvalbumina do bacalhau e, tendo em conta a alta reatividade cruzada que esta proteína apresenta, os resultados podiam não ser significativos. Na análise proteómica foram preparados extratos de músculo de peixes das quatro condições diferentes, seguindo-se uma separação das proteínas através de uma electroforese diferencial em gel a 2 dimensões (2D-DIGE). Nesta técnica as proteínas são separadas consoante o seu peso molecular e ponto isoelétrico e marcadas com flurocromos o que permite a comparação de proteínas pertencentes a diferentes amostras no mesmo gel. As proteínas musculares detectadas como diferencialmente expressas foram retiradas do gel, submetidas a digestão por tripsina e identificadas usando a técnica de espectrometria de massa designada por ionização por dessorção a laser assistida por matriz – tempo de voo/tempo de voo (MALDI-TOF/TOF). A alergenicidade dos peixes foi avaliada através de testes cutâneos (SPTs) e técnicas de imunodeteção utilizando soro de pacientes alérgicos a peixe. Baixas concentrações de EDTA mostraram um impacto positivo na redução da alergenicidade sem efeito sobre o crescimento dos peixes ou propriedades organolépticas o que demonstra possivelmente que uma diferente conformação, menos alergénica da PV foi induzida. Estas baixas concentrações de EDTA tiveram também um ligeiro efeito positivo sobre o pH e a capacidade de retenção de água do músculo possivelmente devido ao facto do EDTA diminuir a disponibilidade de cálcio e assim as protéases dependentes de iões cálcio não serem ativadas. A quantificação do cortisol revelou um estado de stress ligeiramente elevado que pode dever-se a diversas causas como as técnicas de manuseamento. A análise proteómica revelou um ligeiro efeito das dietas enriquecidas com 8% de EDTA sobre a expressão de determinadas proteínas com funções conhecidas como contração muscular, metabolismo de energia, estrutura celular e reguladores de transcrição de DNA e tradução de mRNA. Tal como era esperado, a expressão da PV manteve-se inalterada, o que foi comprovado pela técnica ELISA assim como pela análise proteómica. Os SPTs com pacientes alérgicos a peixe revelaram uma ligeira redução da alergenicidade para peixes submetidos a 3% de concentração de EDTA. Os testes de imunodeteção realizados com soro de pacientes alérgicos a peixe mostraram igualmente uma ligeira redução do potencial alergénico. Este teste preliminar, apesar de requerer estudos complementares, mostra que dietas suplementadas com EDTA são uma medida promissora para modular o potencial alergénico em peixes sendo uma contribuição importante para a segurança alimentar em peixes de aquacultura.
Um crescimento contínuo da população tem sido registado ao longo das últimas décadas, acompanhado de um aumento do consumo de peixe a nível mundial. Este aumento do consumo de peixe, associado à promoção de hábitos alimentares que incita o consumo deste produto alimentar, e à diminuição dos stocks de peixes selvagens nos oceanos levou a uma maior procura de peixes de aquacultura. No entanto, o peixe é um dos principais instigadores de alergias alimentares e estudos que englobem as medidas de criação de peixe em aquacultura para modulação deste potencial alergénico são escassos ou praticamente inexistentes. As alergias alimentares são um problema em crescimento na sociedade atual e uma elevada prevalência das alergias a peixe tem sido registada principalmente em países costeiros e países onde o consumo de peixe é elevado. O principal alergéneo no peixe, designado por β-parvalbumina (β-PV), é responsável por desencadear reações alérgicas mediadas por anticorpos imunoglobulina-E (IgE). A PV é uma proteína do músculo, pequena (Mw ~12 kDa), acídica (pI ~ 6), que participa na contração e relaxamento muscular. Pertence à família designada por EF-hand, caracterizada por apresentar dois domínios EF-hand capazes de se ligarem a iões de cálcio. Assim, esta proteína é capaz de se ligar a dois iões cálcio ao mesmo tempo. A quantidade de PV varia também consoante o tipo de músculo e quantidades mais elevadas desta proteína têm sido associadas a uma maior rapidez de relaxamento muscular. É uma proteína altamente estável a desnaturação química, térmica, e proteolítica, e que apresenta reatividade cruzada com os anticorpos IgE. Esta reatividade cruzada é responsável pelo facto de grande parte dos pacientes alérgicos a peixes serem alérgicos a mais do que uma espécie diferente de peixe. Ou seja, estes domínios de ligação podem apresentar uma elevada homologia entre espécies. Na PV estes domínios proteicos onde se ligam os iões de cálcio apresentam epítopos, zonas onde se ligam os anticorpos IgE, que contêm regiões conservadas de aminoácidos. A capacidade de ligação dos IgE aos epítopos é reduzida aquando da libertação dos iões de cálcio da proteína uma vez que uma diferente conformação é induzida. Assim, o presente trabalho visa reduzir a alergenicidade do peixe de aquacultura induzindo uma forma da PV potencialmente menos alergénica (apo-PV), através de dietas suplementadas com ácido etilenodiaminotratraacético (EDTA). Este quelante de cálcio foi usado neste trabalho como uma ferramenta para diminuir a disponibilidade de cálcio no músculo ou mesmo para retirar os iões de cálcio da PV uma vez que foi provado já em diversos estudos, que o EDTA é capaz de imitar a PV na maioria das suas tarefas de contração/ relaxamento muscular. Doze grupos de douradas (Sparus aurata), constituídos por 25 peixes cada, foram submetidos a quatro condições de crescimento (três tanques para cada condição) diferindo na concentração de EDTA presente na dieta: controlo (0% de EDTA), EDTA3%, EDTA5% e EDTA8%. Após 98 dias de ensaio, os peixes foram abatidos em água e gelo e retiradas amostras de músculo e plasma. Foi realizada uma caracterização bioquímica do músculo do peixe onde foram avaliados os seguintes parâmetros como medidas de qualidade e bem-estar: pH, rigor mortis, capacidade de retenção de água do músculo (WHC), textura e análise sensorial. Foi feita também uma quantificação dos níveis sanguíneos de cortisol nos peixes de modo a poder avaliar-se o estado de stress a que os animais estavam submetidos. Seguiu-se uma quantificação da PV através do método de imunodetecção ELISA. Este método foi validado com uma análise proteómica uma vez que os métodos ELISA disponíveis no mercado apresentam anticorpos contra a parvalbumina do bacalhau e, tendo em conta a alta reatividade cruzada que esta proteína apresenta, os resultados podiam não ser significativos. Na análise proteómica foram preparados extratos de músculo de peixes das quatro condições diferentes, seguindo-se uma separação das proteínas através de uma electroforese diferencial em gel a 2 dimensões (2D-DIGE). Nesta técnica as proteínas são separadas consoante o seu peso molecular e ponto isoelétrico e marcadas com flurocromos o que permite a comparação de proteínas pertencentes a diferentes amostras no mesmo gel. As proteínas musculares detectadas como diferencialmente expressas foram retiradas do gel, submetidas a digestão por tripsina e identificadas usando a técnica de espectrometria de massa designada por ionização por dessorção a laser assistida por matriz – tempo de voo/tempo de voo (MALDI-TOF/TOF). A alergenicidade dos peixes foi avaliada através de testes cutâneos (SPTs) e técnicas de imunodeteção utilizando soro de pacientes alérgicos a peixe. Baixas concentrações de EDTA mostraram um impacto positivo na redução da alergenicidade sem efeito sobre o crescimento dos peixes ou propriedades organolépticas o que demonstra possivelmente que uma diferente conformação, menos alergénica da PV foi induzida. Estas baixas concentrações de EDTA tiveram também um ligeiro efeito positivo sobre o pH e a capacidade de retenção de água do músculo possivelmente devido ao facto do EDTA diminuir a disponibilidade de cálcio e assim as protéases dependentes de iões cálcio não serem ativadas. A quantificação do cortisol revelou um estado de stress ligeiramente elevado que pode dever-se a diversas causas como as técnicas de manuseamento. A análise proteómica revelou um ligeiro efeito das dietas enriquecidas com 8% de EDTA sobre a expressão de determinadas proteínas com funções conhecidas como contração muscular, metabolismo de energia, estrutura celular e reguladores de transcrição de DNA e tradução de mRNA. Tal como era esperado, a expressão da PV manteve-se inalterada, o que foi comprovado pela técnica ELISA assim como pela análise proteómica. Os SPTs com pacientes alérgicos a peixe revelaram uma ligeira redução da alergenicidade para peixes submetidos a 3% de concentração de EDTA. Os testes de imunodeteção realizados com soro de pacientes alérgicos a peixe mostraram igualmente uma ligeira redução do potencial alergénico. Este teste preliminar, apesar de requerer estudos complementares, mostra que dietas suplementadas com EDTA são uma medida promissora para modular o potencial alergénico em peixes sendo uma contribuição importante para a segurança alimentar em peixes de aquacultura.
Description
Dissertação de mestrado, Aquacultura e Pescas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016
Keywords
EDTA Parvalbumina Alergia a peixe Proteómica Reacção de IgEs