Publication
Development of 3d cell cultures and testicular organoid transplantations: potential tools for reproductive biology
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais | |
| dc.contributor.advisor | Cabrita, Elsa | |
| dc.contributor.advisor | Pšenička, Martin | |
| dc.contributor.author | Ferreira, João Gil Gomes | |
| dc.date.accessioned | 2024-07-15T12:38:29Z | |
| dc.date.available | 2024-07-15T12:38:29Z | |
| dc.date.issued | 2023-12-22 | |
| dc.description.abstract | Researchers in the last decade have struggled to increase the number of offspring of species with economic importance or endangered status, reducing aquaculture growth. The primary obstacles are spermatozoa's low number and motility and the long maturation period in some fish species. Germ cell transplantation and cryopreservation techniques enable researchers to surpass problems related to the quality and quantity of spermatozoa. However, the most significant bottlenecks are the low number of spermatogonia germ cells and the incapability to cryopreserve oocytes. Organoids are cell structures only produced in 3D cell mediums, capable of maintaining functionality and structure similar to in vivo. Cell proliferation and differentiation in organoids is the most critical part of their development and an essential step in transplanting them into recipients since there is a probability of increasing the colonisation of the gonadal tissue and decreasing the gonadal maturation period. Therefore, the study and usage of organoids to study epigenetics, cell-cell communication, and cell differentiation are recent strategies in fish biology. The current project aims to reach a consensus on the definition of organoids and be the steppingstone for future work done with fish organoids. Two protocols were produced during these experiments, one for organoid development utilising vitrogel and a second for organoid development through aggrewell plates. The aggrewell procedure was more efficient than any vitrogel, producing more organoids during a smaller period. Despite both mediums achieving organoid-like structures, histology proved that only the aggrewell successfully created organoids with a single membrane and niche structure similar to the donor organ. Preliminary tests with transplanted organoids showed positive results, with observable organoids after 45 days. In summary, the performed experiments will facilitate any work related to future works with fish organoids, surpassing any difficulties in organoid development. | eng |
| dc.description.abstract | Durante as últimas décadas, várias publicações surgiram com o intuito de melhor os processos reprodutivos de animais aquáticos, procedimentos que introduziram a criopreservação, micro-trasplantes e cultura celular de células germinativas. Porem os investigadores têm se deparado com dificuldades em descobrir novos métodos capazes de permitir o aumento do número de descendestes em espécies com valor económico e em estado de perigo de extinção, reduzindo o crescimento da aquacultura. Os principais obstáculos são, o reduzido número de espermatozoa e a sua reduzida mobilidade, a ineficácia na criopreservação de oócitos e os longos períodos de maturação de algumas espécies. Porem o número reduzido de espermatogónias e a incapacidade de crio-preservar oócitos representam as maiores dificuldades do momento. Devido as presentes dificuldades diversas grupos científicos deslocaram o seu foco para o processo reprodutivo, o desenvolvimento das células e a sua diferenciação. Através da utilização de culturas celulares de células germinativas já existentes e subtis alterações dos meios de cultivo (capazes de manter uma estrutura tridimensional) e a adição de hormonas fundamentais no processo de organização e diferenciação celular, foi possível observar uma reorganização das células no meio e a criação de estruturas denominadas esferoides, e eventualmente o desenvolvimento das mesmas e a chegada ao termo organoide. Organoides são estruturas de celulares produzidas em meios de cultura tridimensionais, que são capazes de manter a funcionalidade e a estrutura semelhantes ao órgão in vivo. A comunicação celular em organoides representa a parte mais critica do seu desenvolvimento, uma vez que durante o processo de formação dos organoides as células têm que através de comunicação célula-célula proceder à agregação, proliferação, diferenciação e reorganização de modo a obter uma estrutura semelhante à do órgão dador (membrana celular visível e reorganização celular semelhante ao nicho de onde foram retiradas). O estudo e uso dos organoides em epigenética, comunicação celular, e diferenciação representam uma nova estratégia no estudo da biologia reprodutiva em peixes. O projeto atual visa chegar a um consenso sobre a definição de organoides em peixes uma vez que ainda existem incoerências em vários artigos científicos, (existindo diversos artigos que consideram organoides esferoides e outros que consideram esferoide como sendo organoides) bem como ser o catalisador para trabalhos futuros realizados com organoides em peixes. Durante o período experimental, dois protocolos foram produzidos, um para o desenvolvimento de organoides utilizando diferentes vitrogeis (utiliza uma matriz tridimensional artificial e flexível semelhante a in vivo que permite a movimentação das células, a sua agregação em estruturas 3D) com o intuito de distinguir o mais favorável às células utilizadas, e um segundo com o objetivo de desenvolver organoides através de placas aggrewell (que utilizam força centrífuga e uma placa especifica para aggrewell permitindo assim agregar as células de forma homogenia e obtendo estruturas semelhantes ao longo de toda a placa. Após o procedimento experimental estar concluído, foi possível observar que o protocolo de aggrewell foi o mais eficiente (devido ao método utilizado e à placa, foram observados 1200 organoides com uma media de tamanho de 130.96μm), ultrapassando os resultados obtidos pelo vitrogel 1 (o único vitrogel capaz de produzir organoides).entre os vitrogeis o vitrogel 2 e 4 foram capazes de formar estruturas esferoides mas sem reorganização interna do organoide, por outro lado no vitrogel 3 as células demonstraram dificuldades em se deslocarem e por consequência tiverem dificuldades na fase de agregação. Apesar de não existirem diferenças estatísticas relativamente ao tamanho o mesmo não foi observado relativamente ao tempo necessário para a sua produção, (o protocolo de aggreweel necessita de uma duração de 7 dias e o vitrogel de uma duração de 21) e o número obtido (o aggrewell obteve em média 1200 organoides e o vitrogel uma media de 6). O aggrewell produziu mais organoides durante um menor período de tempo. Apesar de ambos os meios alcançarem estruturas semelhantes a organoides, as análises histológicas realizadas demostraram que apenas os organoides obtidos através do aggrewell tiveram sucesso na produção de organoides, sendo estes os únicos capazes de obter organoides com membrana única visível e estrutura de nicho semelhante ao órgão dador (estruturação das células de Leydig, células de Sertoli e espermatogónios). Durante as análises histológicas é necessário salientar que não foi possível distinguir espermatozoa no interior dos organoides. Com o intuito de testar a qualidade dos organoides produzidos, e a hipótese de a estrutura multicelular dos mesmos lhes conferir uma maior resiliência contra a pressão do elemento recetor pós-transplante (comparar a taxa de sobrevivência dos organoides pós-transplante com a taxa de sobrevivência de células individuais pós-transplante), foram realizados testes preliminares. Os organoides produzidos pelo protocolo de aggrewell (uma vez que estes representam a melhor aproximação a um sistema in vivo) foram transplantados para larvas estéreis de esturjão 15 dias após a sua eclosão. Os organoides foram corados utilizando PKH-26 (Sigma Aldrich) responsável por corar de vermelho a membrana lipídica das células. As larvas foram anestesiadas utilizando 0.03% 2-phenoxyethanol e os organoides foram micro-transplantados para uma zona especifica da larva, entre o intestino e a bexiga natatória. A transplantação foi confirmada através da visualização de organoides corados através de uma lupa de florescência no interior das larvas. Duas observações foram realizadas, a primeira observação 21 dias pós eclosão e a segunda 45 dias pós eclosão. Um total de 10 larvas foram sacrificadas por observação utilizando 0.03% 2-phenoxyethanol como elemento eutanaziante. Ambas as observações realizadas mostraram larvas transplantadas com sucesso, sendo visível células marcadas com PKH-26. Ao dia 21 foi possível observar que 9 em 10 larvas mostraram sinais de marcação, mas sem aparente proliferação colonização dos tecidos. No dia 45 apenas 5 das 10 larvas sacrificadas demostravam marcação porem não foi possível visualizar qualquer proliferação. Em resumo, os protocolos criados durante esta tese tem o intuito de aproximar qualquer investigador interessado em iniciar o seu percurso em organoides testiculares de peixe (principalmente em organoides testiculares de esturjão) da informação mais recente relativamente ao tema, evitando a repetição de experiencias (relacionadas com a mesma espécie) e proporcionando dados que permitem servir de fundação a novos testes e experiencias, superando assim quais queres dificuldades no desenvolvimento de organoides. | por |
| dc.identifier.tid | 203497716 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/25612 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Aquaculture | |
| dc.subject | Sturgeon | |
| dc.subject | Cell culture | |
| dc.subject | Organoid | |
| dc.subject | Transplantation | |
| dc.title | Development of 3d cell cultures and testicular organoid transplantations: potential tools for reproductive biology | eng |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Aquacultura e Pescas |