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- Disclosing proteins in the leaves of cork oak plants associated with the immune response to Phytophthora cinnamomi inoculation in the roots: a long-term proteomics approachPublication . Coelho, Ana Cristina; Pires, Rosa; Schütz, Gabriela; Santa, Cátia; Manadas, Bruno; Pinto, Patricia ISThe pathological interaction between oak trees and Phytophthora cinnamomi has implications in the cork oak decline observed over the last decades in the Iberian Peninsula. During host colonization, the phytopathogen secretes effector molecules like elicitins to increase disease effectiveness. The objective of this study was to unravel the proteome changes associated with the cork oak immune response triggered by P. cinnamomi inoculation in a long-term assay, through SWATH-MS quantitative proteomics performed in the oak leaves. Using the Arabidopis proteome database as a reference, 424 proteins were confidently quantified in cork oak leaves, of which 80 proteins showed a p-value below 0.05 or a fold-change greater than 2 or less than 0.5 in their levels between inoculated and control samples being considered as altered. The inoculation of cork oak roots with P. cinnamomi increased the levels of proteins associated with protein-DNA complex assembly, lipid oxidation, response to endoplasmic reticulum stress, and pyridine-containing compound metabolic process in the leaves. In opposition, several proteins associated with cellular metabolic compound salvage and monosaccharide catabolic process had significantly decreased abundances. The most significant abundance variations were observed for the Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase small subunit (RBCS1A), Heat Shock protein 90-1 (Hsp90-1), Lipoxygenase 2 (LOX2) and Histone superfamily protein H3.3 (A8MRLO/At4G40030) revealing a pertinent role for these proteins in the host-pathogen interaction mechanism. This work represents the first SWATH-MS analysis performed in cork oak plants inoculated with P. cinnamomi and highlights host proteins that have a relevant action in the homeostatic states that emerge from the interaction between the oomycete and the host in the long term and in a distal organ.
- Using gradient Forest to predict climate response and adaptation in Cork oakPublication . Vanhove, Mathieu; Pina-Martins, Francisco; Coelho, Ana Cristina; Branquinho, Cristina; Costa, Augusta; Batista, Dora; Principe, Adriana; Sousa, Paulo; Henriques, Andre; Marques, Isabel; Belkadi, Bouchra; Knowles, L. Lacey; Paulo, Octavio S.Climate change is impacting locally adapted species such as the keystone tree species cork oak (Quercus suber L.). Quantifying the importance of environmental variables in explaining the species distribution can help build resilient populations in restoration projects and design forest management strategies. Using landscape genomics, we investigated the population structure and ecological adaptation of this tree species across the Mediterranean Basin. We applied genotyping by sequencing and derived 2,583 single nucleotide polymorphism markers genotyped from 81 individuals across 17 sites in the studied region. We implemented an approach based on the nearest neighbour haplotype 'coancestry' and uncovered a weak population structure along an east-west climatic gradient across the Mediterranean region. We identified genomic regions potentially involved in local adaptation and predicted differences in the genetic composition across the landscape under current and future climates. Variants associated with temperature and precipitation variables were detected, and we applied a nonlinear multivariate association method, gradient forest, to project these gene-environment relationships across space. The model allowed the identification of geographic areas within the western Mediterranean region most sensitive to climate change: south-western Iberia and northern Morocco. Our findings provide a preliminary assessment towards a potential management strategy for the conservation of cork oak in the Mediterranean Basin.
- Spectral analysis, biocompounds, and physiological assessment of Cork Oak leaves: unveiling the interaction with Phytophthora cinnamomi and beyondPublication . Guerra, Rui; Pires, Rosa; Brazio, António; Cavaco, Ana Margarida; Schütz, Gabriela; Coelho, Ana CristinaThe cork oak tree (Quercus suber L.) symbolizes the Montado landscape in Portugal and is a central element in the country’s social and economic history. In recent decades, the loss of thousands of cork oaks has been reported, revealing the ongoing decline of these agroforestry ecosystems. This emblematic tree of the Mediterranean Basin is host to the soil-born root pathogen Phytophthora cinnamomi, an active cork oak decline driver. In this framework, the early diagnosis of trees infected by the oomycete by non-invasive methods should contribute to the sustainable management of cork oak ecosystems, which motivated this work. Gas exchange and visible/near-infrared (400–1100 nm) reflectance spectroscopy measurements were conducted on leaves of both control and P. cinnamomi inoculated plants. These measurements were taken at 63, 78, 91, 126, and 248 days after inoculation. Additionally, at the end of the experiment, biochemical assays of pigments, sugars, and starch were performed. The spectroscopic measurements proved effective in distinguishing between control and inoculated plants, while the standard gas exchange and biochemistry data did not exhibit clear differences between the groups. The spectral data were examined both daily and globally, utilizing the PARAFAC method applied to a three-way array of samples × wavelengths × days. The separation of the two plant groups was attributed to variations in water content (4v (O−H)); shifts in the spectra red edge; and structural modifications in the epidermal layer and leaves’ mesophyll. These spectral signatures can assist in the field identification of cork oaks that are interacting with P. cinnamomi.
- Genetic diversity of two evergreen oaks [Quercus suber (L.) and Quercus ilex subsp rotundifolia (Lam.)] in Portugal using AFLP markersPublication . Coelho, Ana Cristina; Lima, M. B.; Neves, D.; Cravador, AlfredoThe genetic variability of cork oak (Quercus suber, L.) in Portugal was evaluated by AFLP using five primer combinations. Three hundred and thirteen trees from three geographically contrasting regions exhibited a high level of genetic variation. The genetic profile of each individual is composed of 291 loci, randomly positioned in the genome and consists of monomorphic and polymorphic fragments. Similarities and dissimilarities among the individuals were quantitatively evaluated by numerical taxonomy. The overall sample shows a proportion of AFLP polymorphic markers of 71%, denoting a high level of variability. Ninety percent of the polymorphic markers identified in cork oak genotypes are uniformly distributed throughout the cork oak populations of Algarve, Alentejo and Tras-os-Montes regions. The coefficients of genetic similarity vary from 0.61 to 0.88 implying that 60% of fragments found are common. A sample of 52 holm oak [Quercus ilex subsp. rotundifolia (Lam.)] trees from overlapping areas was also analysed by AFLP with the same five primer combinations. However the codification of markers together with those selected on cork oak profiles was feasible with only one primer combination due to an apparent much higher polymorphism. AFLP and numerical taxonomy analysis enabled to differentiate the taxa and showed that the level of similarity observed between the profiles of the individuals from holm oak species was lower than that observed in cork oak, implying that apparently the degree of polymorphism is higher in Q. ilex subsp. rotun-difolia than that quantified in Q. suber. A Bayesian approach was used to assess Q. suber total genetic diversity (Ht = 0.2534, P < 0.001) of which 1.7% (Fst = 0.0172, P < 0.001) was assigned to differences among populations. Analysis of molecular variance (AMOVA) showed that most genetic variation is comprised within populations (96%) while 3.6% is among populations (Phi st = 0.036, P < 0.001). Differences among populations within geographic regions account for 2.6% (Phi sc = 0.026, P < 0.001) of the total variation and only 1.3% (Phi ct = 0.013, P = 0.007) is attributed to variation among regions denoting little differentiation of populations over a range of 700 km.
- Protein markers for the identification of cork oak plants infected with phytophthora cinnamomi by applying an (α, β)-k-feature set approachPublication . Coelho, Ana Cristina; Schütz, GabrielaCork oak decline in Mediterranean forests is a complex phenomenon, observed with remarkable frequency in the southern part of the Iberian Peninsula, causing the weakening and death of these woody plants. The defoliation of the canopy, the presence of dry peripheral branches, and exudations on the trunk are visible symptoms used for the prognosis of decline, complemented by the presence of Phytophthora cinnamomi identified in the rhizosphere of the trees and adjacent soils. Recently, a large proteomic dataset obtained from the leaves of cork oak plants inoculated and non-inoculated with P. cinnamomi has become available. We explored it to search for an optimal set of proteins, markers of the biological pattern of interaction with the oomycete. Thus, using published data from the cork oak leaf proteome, we mathematically modelled the problem as an α, β-k-Feature Set Problem to select molecular markers. A set of proteins (features) that represent dominant effects on the host metabolism resulting from pathogen action on roots was found. These results contribute to an early diagnosis of biochemical changes occurring in cork oak associated with P. cinnamomi infection. We hypothesize that these markers may be decisive in identifying trees that go into decline due to interactions with the pathogen, assisting the management of cork oak forest ecosystems.
- Equilíbrios e desequilíbrios no Montado Filme em animação sobre o declínio do sobreiro em PortugalPublication . Graça, Marina Estela; Correia, Gisela; Coelho, Ana Cristina; Schimiguel, Juliano; Frenedozo, Rita de Cássia; Coelho, Ana Cristina Hurtado de MatosEm 2016, na Escola Superior de Educação e Comunicação da Universidade do Algarve, iniciou-se um projeto para a realização de um filme de animação (https://youtu.be/XDNKewRGNJs) com o objetivo de comunicar o declínio do sobreiro em Portugal.. O declínio do sobreiro caracteriza-se por uma deterioração progressiva dos sistemas florestais e agro-florestais (Montado) de sobreiro e azinheira, predominantes no sul da Península Ibérica, na Europa. Este fenómeno provoca, anualmente, a morte de milhares de árvores e tem consequências económicas (comercialização da cortiça), geográficas (erosão dos solos e desertificação), sociais (fixação das populações; emigração) e ecológicas (níveis de biodiversidade da flora e da fauna). A caracterização do declínio do sobreiro é multifacetada, destacando-se as alterações climáticas, a gestão da floresta ou montado e os stresses biológicos e abióticos como fatores reconhecidamente envolvidos. O filme de animação aborda um tipo de stresse biótico, muito estudado, ou seja, a infeção dos sobreiros pelo agente patogénico Phytophthora cinnamomi, um oomiceta filamentoso, presente nas raízes de plantas hospedeiras infetadas e no solo circundante. Uma vez que o filme foi produzido em contexto de formação académica em Imagem Animada, da Universidade do Algarve, este documento visa enquadrar o seu processo de realização com técnicas de animação, enquanto conteúdo de divulgação de ciência e de construção de literacia científica. Assim sendo, apresenta-se a análise do filme, dividido em três partes, associando-lhe os recursos metodológicos e logísticos usados, a interpretação científica e função comunicativa do conteúdo das imagens. Aborda-se, ainda, a relevância do projeto na formação de profissionais em Imagem Animada e a utilidade do filme como material didático promotor de literacia científica.
- Estratégia pedagógica no Ensino Superior baseada no conceito de aprendizagem ativaPublication . Conceição, Ana C.; Coelho, Ana Cristina; Dionísio Gonçalves, CarlaO sucesso no Ensino Superior, em qualquer área de conhecimento, passa pelo comprometimento do aluno no processo de aprendizagem e pela visão do professor como agente facilitador e conhecedor do processo de ensino e de aprendizagem. Neste trabalho descreve-se uma estratégia pedagógica usada no Ensino Superior, na Unidade Curricular (UC) de Cálculo I, norteada pelo conceito de aprendizagem ativa centrada no aluno. Dos 48 alunos inscritos na UC, 30 alunos participaram em atividades realizadas em sala de aula, reconhecidamente associadas ao modelo metodológico de aprendizagem ativa, destacando-se o uso de software educativo e a resolução de problemas, efetuada individualmente e/ou em grupo, com partilha e reflexão acerca das estratégias de resolução. As formas de avaliação foram adequadas ao modelo e a monitorização da satisfação dos alunos foi feita através de um questionário. Realça-se a adequação do conceito F-Tool ao conceito de aprendizagem ativa, em virtude de permitir, em sala de aula, uma abordagem dinâmica e interativa de diversos conceitos relacionados com o estudo de funções e de promover novas formas de raciocinar/pensar, avaliar, ensinar e aprender. As estratégias associadas às atividades realizadas em sala de aula, motivaram a aprendizagem num contexto de comunicação colaborativa onde todos foram intervenientes. Estas ações convidaram ao pensamento reflexivo e criativo, essenciais para a construção de novos conhecimentos. A aprovação na UC dos alunos abrangidos pela estratégia pedagógica esteve próxima dos 100%. Os aspetos que os estudantes mais evidenciaram nas respostas ao questionário foram a autorregulação do estudo e a autoconfiança na aprendizagem.
- Estudo da biodiversidade molecular de Quercus suber e caracterização de genes envolvidos na resposta de defesa à infecção por Phytophthora cinnamomiPublication . Coelho, Ana Cristina; Cravador, A.O sobreiro (Quercus suber L.) é uma espécie autóctone que se encontra distribuída em todo o território de Portugal Continental. São excepção as regiões montanhosas mais frias do norte e centro, as regiões salinas junto ao litoral e as zonas do interior de acentuada aridez. Os indivíduos desta espécie apresentam características morfológicas muito variadas com ocorrência de diversas gradações entre caracteres do mesmo órgão e diferentes graus de tolerância, aparente, à doença do declínio. A semelhança genómica descrita dentro do género Quercus determina a ausência de barreiras reprodutivas e possibilita fenómenos de hibridação nos povoamentos mistos de Q. suber e Q. rotundifolia. O recurso à análise do DNA para determinação do perfil genético dos indivíduos de uma espécie, consiste no método mais recente de individualização biológica. No presente estudo, foi avaliada a variabilidade genética em Q. suber por AFLP (amplified fragment length polymorphism), com cinco combinações de primers diferentes, que permitiram diferenciar 313 árvores provenientes do Algarve, Alentejo e Trás-os-Montes, de acordo com o seu genótipo. O perfil genético de cada sobreiro resultou da análise de 291 loci aleatórios do genoma, presentes na forma de fragmentos monomórficos e polimórficos. A avaliação quantitativa das semelhanças ou dissemelhanças entre os indivíduos foi determinada pelo método de análise de dados/taxonomia numérica. A percentagem de polimorfismo detectada nos sobreiros é de 71 % e é indicadora de índices elevados de variabilidade na espécie. A diversidade genética é semelhante nas populações estudadas do Algarve, Alentejo e Trás-os-Montes. A elevada variação fenotípica que se observa em Q. suber ao nível da qualidade da cortiça produzida e da aparente tolerância à doença do declínio é reflectida nos padrões AFLP. Os valores dos coeficientes de semelhança genética variam entre 0,88 e 0,61, o que significa que, apesar da elevada diversidade genética, os sobreiros partilham entre si 60 % do genoma. No grupo dos 313 indivíduos de Q. suber observa-se uma tendência para a separação em dois subgrupos. Na análise por AFLP com uma das combinações de primers, a combinação I9, foram incluídas 52 azinheiras provenientes das mesmas três regiões, Algarve, Alentejo e Trás-os-Montes, dos sobreiros. Duas destas azinheiras foram estudadas, também, com as outras quatro combinações de primers referidas para os sobreiros. Em todas as combinações de primers houve diferenciação entre os 313 indivíduos da espécie Q. suber e os dois indivíduos da espécie Q. rotundifolia, em concordância com a classificação sistemática destes Quercus. Na análise em que se incluíram as 52 azinheiras e os 313 sobreiros, identificaram-se indivíduos pertencentes a uma terceira espécie. Através da determinação de perfis genéticos de indivíduos de espécies diferentes do género Quercus é possível determinar as relações filogenéticas existentes entre eles. Um dos 291 marcadores AFLP está presente em quase todas as azinheiras e em onze sobreiros e este facto revela que pode ter sido adquirido por hibridação entre as duas espécies de Quercus. A metodologia usada permitiu identificar marcadores moleculares potencialmente correlacionados com fenótipos de tolerância à doença do declínio e à qualidade da cortiça. Alguns marcadores só estão presentes em sobreiros de determinada região e podem ser o resultado dum processo de adaptação ao meio. Em Portugal e Espanha a doença do declínio afecta, de um modo geral, os povoamentos de sobreiro e azinheira, atinge indivíduos de todas as idades e manifestase na forma de declínio lento ou morte súbita. O fungo do solo, Phytophthora cinnamomi, aparece invariavelmente associado aos locais de declínio e tem sido isolado, com frequência, a partir de raízes de sobreiros e azinheiras. Q. suber e Q. rotundifolia são, portanto, hospedeiros de P. cinnamomi e o fungo é capaz de colonizar os tecidos, sendo desconhecidos os mecanismos moleculares da interacção entre o hospedeiro e o agente patogénico. Através da análise do RNA mensageiro, por cDNA-AFLP, de raízes de Q. suber e Q. rotundifolia infectadas com P. cinnamomi, de folhas de plântulas de sobreiros cultivados em solos artificialmente infestados e de folhas de sobreiros localizados em locais de declínio, naturalmente infestados com o fungo, foram identificados fragmentos de genes que se expressam de forma diferencial durante a interacção. As sequências de quatro destes fragmentos apresentam homologia com genes relacionados com o sistema de defesa noutras espécies de plantas. As sequências nucleotídicas foram determinadas a partir dos cDNAs correspondentes obtidos por RACE-PCR ou, alternativamente, a partir dos genes isolados num banco genómico de Q. suber em Lambda FIX II escrutinado com sondas específicas. Foram identificados e caracterizados em Q. suber, os genes QsCAD1, QsRPc, QsPDI e QsRSH que codificam uma cinamil álcool desidrogenase 1, uma proteína de resistência a P. cinnamomi, uma isomerase de pontes dissulfureto proteica e uma proteína do tipo RelA/SpoT, respectivamente. Pelo menos três destes genes estão potencialmente envolvidos na resposta à infecção por P. cinnamomi; com efeito a expressão de QsCAD1, QsRPc e QsPDI aumenta durante as primeiras 24 horas de interacção. É conhecido que o sistema de defesa nas plantas é multifacetado e que a transcrição dos genes do metabolismo de fenilpropanóides é activada durante a interacção com agentes patogénicos. A partir de fragmentos obtidos por PCR com primers de sequência heterogénea definidos a partir de sequências conhecidas de genes do metabolismo de fenilpropanóides doutras espécies de plantas, foram determinadas sequências nucleotídicas parciais codificando uma peroxidase (QsPOX), uma cinamil álcool desidrogenase 2 (QsCAD2) e uma fenilalanina amónia liase (QsPAL) em Q. suber. Com base nesta informação foram clonados, sequenciados e caracterizados, parcial ou completamente, o cDNA e/ou DNA dos genes QsPOX (1 e 2), QsCAD2 e QsPAL que codificam duas peroxidases catiónicas, uma cinamil álcool desidrogenase e uma fenilalanina amónia liase, respectivamente. A expressão destes genes foi analisada por RT-PCR e hibridação com sondas específicas marcadas com digoxigenina, a partir de RNA total extraído de raízes de Q. suber que estiveram em contacto com o fungo durante 24 horas, verificando-se que QsPOX2 e provavelmente, QsPOX1, estão envolvidas na resposta de defesa. Relativamente aos genes QsCAD2 e QsPAL os resultados não foram conclusivos. Tendo em consideração a homologia entre as sequências de aminoácidos deduzidas dos genes identificados em Q. suber com a de proteínas já caracterizadas noutras espécies, foi possível conceber um modelo hipotético que ilustra os acontecimentos iniciais da interacção entre o fungo e o hospedeiro. Deste modo, considera-se que a infecção de Q. suber por P. cinnamomi apresenta contornos de interacção compatível e incompatível. O fungo induz a expressão de genes potencialmente implicados na desactivação de factores de virulência (toxinas) e de genes de defesa implicados no reconhecimento de factores de avirulência. A variante da doença do declínio denominada “morte súbita” estaria associada à produção duma isoforma do produto do gene QsCAD1, incapaz de converter o factor de virulência (toxina) produzido pelo fungo, num produto não tóxico para a célula. Num sobreiro que sofreu morte súbita foi identificado um fragmento polimórfico deste gene que apoia esta hipótese. O declínio lento resultaria da resistência parcial ao fungo, relacionada com a rapidez de reconhecimento dos factores de avirulência.