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Browsing UAlg-Teses by Field of Science and Technology (FOS) "Ciências Médicas"
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- Antibiotherapy of infections caused by multidrug-resistant Gram-positive cocciPublication . Matos, Carlos Adriano Albuquerque Andrade de; Conceição, Jaime Manuel Guedes Morais daSince the discovery of penicillin almost 100 years ago, antibiotics have revolutionized the treatment of many bacterial infections that were previously incurable and often lethal. Nonetheless, success of antibiotherapy is currently challenged by the emergence and dissemination of antimicrobial resistance, which occurs when changes in microorganisms render drugs ineffective. Misuse of antibiotics in humans, animals and the environment is often presented as one of the main causes for the selection of microorganisms that are increasingly resistant to currently available antimicrobial agents. Infections by resistant pathogens constitute one of the most important threats to global public health in the 21st century, being associated with high levels of morbidity and mortality, as well as a significant economic burden. Recent estimates suggest that, in 2019, approximately 1.27 million deaths worldwide were attributable to antibiotic-resistant bacterial infections. Among these, more than 141.000 deaths were attributable to three multidrug-resistant Gram-positive cocci, namely: methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), vancomycin-resistant Staphylococcus aureus (VRSA) and vancomycin-resistant Enterococcus (VRE). These bacteria are responsible for a large percentage of nosocomial infections and constitute a priority for new antimicrobial drug development. This Dissertation aims to explore and analyze the current pharmacological approaches to the treatment of infections caused by the above bacteria. A description of these pathogens will be performed, addressing, among other relevant characteristics, their principal resistance mechanisms and the main clinical syndromes they can cause. Then, current antibiotherapeutic approaches used to manage each syndrome will be presented. The main pharmacological characteristics of each of the principal drugs mentioned in this context will be described, including its mechanism of action, posology and administration route, pharmacokinetic features, undesirable effects and main pharmacological interactions. Comprehension of existing antibiotherapy practices will contribute to the optimization of the use of available medicines and will help delineate the future of multi-drug resistant Gram-positive cocci anti-infective chemotherapy.
- Characterization of the contribution of S-nitrosylated proteins to the aggregation of alpha-synuclein in Parkinson´s DiseasePublication . Teixeira, Mariana Filipa Fernandes; Araújo, Inês; Outeiro, TiagoAlpha-synuclein (-Syn) is present in Lewy Bodies and its aggregation has been associated with Parkinson's disease (PD). However, the cause of -Syn aggregation is unknown. An increase in reactive nitrogen species (RNS) in PD has been described, which can lead to oxidative posttranslational modifications such as S-nitrosylation. This chemical process involves the covalent attachment of a nitric oxide group (NO) to a cysteine thiol within a protein to generate an S-nitrosothiol (SNO). Because it does not have cysteine residues in its structure, -Syn is not a direct target of S-nitrosylation. When S-nitrosylated, enzymes such as protein disulfide isomerase (PDI) and serine racemase (SR) can cause misfolded proteins to aggregate. Nonetheless, no research has been conducted to determine how S-nitrosylation of these proteins is involved in -Syn aggregation. The current study aimed to determine how S-nitrosylation in the proteome, induced by CysNO treatment, affects -Syn aggregation and cell viability by examining the presence of -Syn aggregates and cleaved caspase-3 in SH-SY5Y cells expressing WT, A53T, or A30P -Syn. The western blot results indicate that PDI is indeed S-nitrosylated. However, SR was not proven to be S-nitrosylated. These results indicate that only one protein (PDI) may contribute to the aggregation process of - Syn. Using the immunocytochemistry technique, the percentage of transfected cells, the number of transfected cells with aggregates, the presence of cleaved caspase-3 (an indicator of cell death) and the presence of condensed/fragmented nuclei were quantified. These results showed that S-nitrosylation increases aggregation of -Syn, depending on its form. And that the amount of cytotoxicity present in cells exposed to CysNO is not significant. These studies suggest that S-nitrosylation may increase the aggregation process of -Syn. Future studies could elucidate a cause-effect between the nitrosylation of proteins such as PDI and the aggregation of -Syn.
- Differential Setup of PI3K/AKT and JAK/STAT pathways in fibrotic vs regenerative healing in mammalsPublication . Pinheiro, Gonçalo Goulart da Silva; Tiscórnia, Gustavo; Araújo, InêsA regeneração epimórfica em mamíferos é um fenómeno raro e pouco compreendido, mas há muito tempo que captura a imaginação humana, com a promessa de uma completa recuperação na sequência de um ferimento grave. Por esta razão, os cientistas estão há mais de um século a tentar compreender porque alguns animas têm um potencial desta característica tão superior aos humanos, para que talvez sejamos capazes de o recriar em nós. Os vertebrados inferiores, como salamandras, sapos e peixes teleósteos, são capazes de regenerar vários tecidos e órgãos, incluindo o coração, mandíbula, apêndices, etc., recuperando completamente a funcionalidade. Compreender como um processo regenerativo é estabelecido em resposta a um ferimento, nestes organismos, tem-nos ajudado a compreender algumas limitações do nosso próprio sistema, mas uma compreensão completa requer o nosso entendimento de como este fenómeno ocorre em espécies mais próximas de nós, com as quais partilhamos, por exemplo, uma resposta imunitária adaptativa complexa. Recentemente, algumas espécies de cervídeos e murídeos foram associados a uma impressionante capacidade de regenerar as suas hastes e tecidos associados, e os seus pavilhões auriculares e pele do dorso, respetivamente. Além disso, foi demonstrado que a regeneração nestes modelos tem uma forte relação com a resposta imunitária, e é dependente da sinalização MAPK/ERK, algo que também já foi demonstrado em processos regenerativos de vertebrados inferiores. A sinalização MAPK/ERK é conhecida por controlar vários processos celulares, principalmente proliferação, portanto não é de espantar que esteja envolvida em eventos regenerativos. A sinalização MAPK/ERK também é conhecida por interagir com outras vias de sinalização intracelulares, principalmente com a sinalização PI3K/AKT, contribuindo para a integração de outros sinais, como disponibilidade nutricional e presença de fatores de stress, ajudando a célula a decidir o seu destino. Apesar de ser indispensável para a regeneração, e ser capaz de induzir algumas características de regeneração num processo fibrótico, a sobre ativação da sinalização MAPK/ERK em mamíferos não é suficiente para o transformar completamente num evento regenerativo. Isto é indicativo de que provavelmente haverá outras vias de sinalização diferencialmente ativas entre os processos, e um melhor entendimento de como a proliferação é regulada nestes processos, em particular na regeneração em mamíferos, é necessário. Em particular, como é que células, quando confrontadas com tal stress, tomam a decisão de proliferar, em vez de escolherem outro destino, como morte celular programada, e como é que o sistema imunitário influência este processo. Com esse fim, de melhor entender essa regulação, neste trabalho procedemos ao isolamento de populações de células proliferativas que se formam durante o processo de resposta a uma perfuração circular do pavilhão auricular de duas espécies de mamífero, uma apresenta uma resposta regenerativa, e outra uma fibrótica, e analisámos os seus perfis transcricionais em vários pontos da sua resposta inicial a esse ferimento (hemóstase, inflamação e proliferação). Ao fazermos isso, observámos que, apesar de alguma, ainda que escassa, semelhança, estas duas populações proliferativas representam respostas amplamente distintas. Em particular, o perfil transcricional de A. cahirinus mostrou uma forte associação com processos envolvidos no metabolismo energético e proliferação, enquanto o perfil transcricional das populações proliferativas de M. musculus associou-se mais significativamente com processos relacionados com dinâmicas citoplasmáticas, provavelmente associadas a migração, e diferenciação de vários tecidos. Enquanto a regulação da proliferação de M. musculus se associou principalmente à via de sinalização de MAPK/ERK, o perfil transcritómico de A. cahirinus associou-se a mais vias de sinalização, nomeadamente à via PI3K/AKT, WNT e NF-KB, além de MAPK/ERK. A comparação dos perfis transcricionais também sugeriu um envolvimento distinto de fatores de transcrição na regulação da proliferação. Também encontrámos uma associação do perfil transcricional de A. cahirinus com uma resposta apoptótica, associação essa que não foi observada em M. musculus. Apesar de grupos distintos de vias de sinalização estarem associados com a resposta de cada uma das espécies estudadas, ambas as respostas são conhecidas por envolver igualmente algumas das mesmas vias de sinalização, mas com resultados distintos. Por causa disso, decidimos analisar como é que estas vias de sinalização estão montadas, e as dinâmicas da sua ativação em ambas as espécies. Nós observámos que, aparentemente, a proporção de mediadores e as interações que estabelecem, em três vias de sinalização intracelulares, nomeadamente MAPK/ERK, PI3K/AKT e JAK/STAT, conhecidas por interagirem entre si na regulação de vários processos celulares, em particular na proliferação, não são idênticas entre as espécies. Por exemplo, M. musculus aparenta ter uma preferência por ativar uma das isoformas de ERK1/2, enquanto o mesmo não se observa em A. cahirinus. Adicionalmente, as dinâmicas temporais de ativação sugerem que cada isoforma tem a sua própria dinâmica, com ERK2 aparentemente associado a uma resposta precoce, e ERK1 possivelmente envolvido no suporte da resposta proliferativa. Quanto à via de sinalização PI3K/AKT, nós observámos uma abundância relativa consistentemente superior de AKT1 ativado em M. musculus, onde a sua ativação parece aumentar em particular nas primeiras 12h depois do ferimento. Além disso, a resposta desta via de sinalização aparenta ser bimodal, com um tipo de resposta precoce e outro mais tardio, possivelmente associado com uma indução de apoptose em A. cahirinus brevemente após lesão, algo que aparenta não acontecer em M. musculus. Esta indução talvez contribua para suster a proliferação, algo que tem sido associado com uma constante produção de fatores mitogénicos por parte de células pré-apoptóticas, que podem permanecer neste estado por largos períodos. A via de sinalização JAK/STAT, por outro lado, exibe uma clara e sustentada proporção de JAK2 ativado mais elevada em A. cahirinus. No entanto, esta atividade superior não se traduziu em consideráveis diferenças nos níveis de ativação de STAT3, o que sugere que JAK2 poderá ter outros papéis no processo de resposta a ferimento nestas duas espécies. Isto poderá constituir um método que as células proliferativas, neste contexto, usam para integrar sinais do sistema imunitário na regulação da sua proliferação, visto que JAK2 pode transativar recetores que atuam acima da sinalização MAPK/ERK e PI3K/AKT, como os recetores ERBB. No seu todo, o nosso trabalho sugere a existência de duas estratégias muito distintas de resposta a um ferimento, entre processos regenerativos e fibróticos em mamíferos, e sugere que isto não só se deve a uma resposta distinta aos mesmos estímulos, mas também que esta resposta distinta poderá dever-se a composições alternativas destas vias de sinalização intracelulares, que vão elas próprias gerar os resultados distintos destes dois tipos de resposta. Mais exploração destas vias de sinalização, e da resposta dos seus participantes, aos estímulos presentes durante a resposta a ferimentos irão ajudar-nos a perceber o conjunto ideal de fatores a utilizar para transformar processos fibróticos em regenerativos em animais com potencial regenerativo inferior.
- Modo de acção de chaperones na montagem do proteassoma 20S de Saccharomyces cerevisiaePublication . Tiago, Maria Margarida A. V. Neto; Ramos, PaulaA degradação selectiva e controlada de proteínas celulares é essencial na manutenção da homeostasia celular. Este processo é mediado pelo sistema Ub/proteassoma, no qual o proteassoma 26S assume uma grande relevância. Este complexo é composto por duas partículas reguladoras 19S e um complexo catalítico, o proteassoma 20S. Embora a estrutura deste ultimo seja conhecida, muitos aspectos da via de montagem continuam por esclarecer, nomeadamente o envolvimento de chaperones específicos e intramoleculares. Neste trabalho pretendeu-se clarificar alguns aspectos acerca do modo de acção dos chaperones específicos Ump1 e Poc1-Poc2, bem como da participação do propeptídeo da subunidade catalítica β2 como chaperone intramolecular no processo de montagem do proteassoma 20S de Saccharomyces cerevisiae, utilizando uma combinação de técnicas moleculares e bioquímicas, juntamente com ensaios de interacção in vitro. De acordo com os resultados, a perda do propeptídeo de β2 é prejudicial para a célula, porém quando a subunidade matura é sobrexpressa a 30 º C, as células recuperam quase na totalidade o fenótipo wild type. Embora a forma matura de β2 presente no complexo 20S não interaja com Ump1, verificou-se que a forma não processada presente no complexo 15S tem a capacidade de interagir com este chaperone. Adicionalmente, tentaram caracterizar-se os complexos precursores 15S formados, na ausência de Ump1. Os dados obtidos mostram a presença de intermediários 15S com alta instabilidade quando sujeitos a electroforese em condições nativas. Relativamente a Poc1-Poc2, os resultados sugeriram que este chaperone se encontra enclausurado no interior do complexo 20S recém-formado, sendo degradado como substrato do proteassoma 20S após a maturação dos locais activos. Com este trabalho foram obtidas novas evidências no sentido de uma melhor compreensão da montagem do proteassoma 20S assistida por chaperones.