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Percorrer FCB1-Teses por Objetivos de Desenvolvimento Sustentável (ODS) "04:Educação de Qualidade"
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- Análise Bioinformática da Via Hedgehog em Cancros Humanos: Expressão, Metilação e Impacto Prognóstico no KIRC e LGGPublication . Aguiar, Diogo Gonçalo Ribeiro Paulo e Soares; Tavares, ÁlvaroO cancro é um dos maiores desafios da saúde global, resultando de alterações genéticas, epigenéticas e da desregulação de vias de sinalização. Esta tese centrou-se na via Hedgehog (HH), conservada evolutivamente e crucial no desenvolvimento embrionário, frequentemente desregulada em vários tipos de neoplasias. O objetivo principal foi analisar a expressão diferencial dos genes da via HH e associados em diversos cancros, com foco no carcinoma renal de células claras (KIRC) e no glioma de baixo grau (LGG), avaliando também o seu impacto prognóstico e potenciais mecanismos regulatórios. Utilizando abordagens bioinformáticas e bases de dados públicas (TCGA, GTEx, GEPIA2, cBioPortal, MethSurv, STRING, TIMER2.0, UCSC Xena Browser e UALCAN), foram analisados dados de expressão génica, metilação de DNA, mutações, infiltração imune e interações moleculares. Verificaram-se diferenças relevantes na expressão de CDON e LRP2 (KIRC) e de KIF7, BOC, CSNK1A1, CSNK1G3, PTCH1, GAS1, SMO e SUFU (LGG) entre tecidos tumorais e normais. A expressão elevada de LRP2 e CDON associou-se a melhor sobrevivência em KIRC, enquanto SUFU e PTCH1 mostraram efeito protetor em LGG. Por outro lado, SMO e GAS1 foram associados a pior prognóstico em LGG. Foi ainda observada hipermetilação dos promotores de CDON e LRP2 em KIRC, sugerindo regulação epigenética, enquanto em LGG a desregulação parece ocorrer por mecanismos não mutacionais. As redes de coexpressão revelaram interações com vias como Wnt e PI3K/AKT. Conclui-se que a via HH tem impacto distinto consoante o subtipo tumoral, e alguns genes, como LRP2 e CSNK1A1, podem constituir biomarcadores ou alvos terapêuticos promissores, reforçando a importância de análises multi-ómicas aplicadas à oncologia de precisão.
- Assessing the importance of deltaC mRNA 3’utr for zebrafish somitogenesisPublication . Rodrigues, Leonardo Abraão da Silva; Andrade, Raquel P.; Carraco, GilSomitogenesis is a critical process in early vertebrate development, leading to the periodic formation of somites from the presomitic mesoderm (PSM) along the rostral-caudal axis during body elongation. These somites, which serve as embryonic precursors to the axial skeleton, are crucial for the proper development of vertebrae and other segmented structures. While the periodicity of somite formation can vary significantly between species, it remains highly constant within each species. This periodicity is driven by the embryo clock (EC), an intrinsic mechanism in PSM cells that relies on oscillations of gene expression, regulated through negative feedback loops, requiring short-lived mRNA transcripts. The stability of these transcripts is influenced by regulatory regions (RR) within the mRNA 3’ Untranslated Region (3’UTR). Proper somite formation requires synchronization between PSM cells, facilitated by Notch-Delta signaling, which coordinates cellular division and differentiation. This work investigated the role of the 3’UTR of the zebrafish deltaC clock gene in somite formation periodicity. Various zebrafish mutant lines were generated using CRISPR/Cas9. A previously generated mutant line (RR2) was characterized, assessing somite number, size, periodicity of formation, as well as the expression of EC genes. The comparison between the RR2 mutant and wildtype embryos showed no differences in somite size or number. Also, deltaC and her7 clock gene expression were unaltered. However, the RR2 mutant showed a slight decrease in the periodicity of somite formation. In conclusion, this work describes new animal model systems to study the embryo clock and provided new data on the importance of deltaC mRNA 3’UTR for somite formation.
- Associação entre o infiltrado linfoide e expressão de KI-67 com diversos fatores clínico-patológicos em cancro da mama luminalPublication . Almeida, Érica Filipa Pinto de; Borralho, Paula; Tavares, ÁlvaroAtualmente o cancro da mama continua a ter uma grande importância a nível mundial, particularmente no que respeita à sua incidência e mortalidade. Neste contexto, o diagnóstico correto e precoce apresentam um valor imensurável, contribuindo assim para a cura deste tumor. Muitos são os estudos realizados que procuram encontrar fatores preditivos e de prognóstico, de modo a auxiliar a tarefa árdua de diagnosticar, orientar a terapêutica e avaliar o prognóstico do cancro da mama. No entanto, atualmente este tema ainda carece de respostas para muitas questões. Com o intuito de encontrar algumas respostas, no presente estudo foram analisadas correlações entre várias variáveis clínicas, histológicas e biológicas, a fim de validar determinados biomarcadores, como fatores preditivos e de prognóstico. Neste projeto, foi nosso objetivo comparar duas coortes de carcinoma da mama de tipos histológicos diferentes (carcinoma lobular invasivo e carcinoma sem tipo especial), mas com grau de diferenciação e estádios clínicos e patológicos sobreponíveis. Foram selecionados 60 casos de carcinoma da mama, dos quais 30 carcinomas lobulares e 30 carcinomas de tipo NST e foram recolhidas as características específicas de cada tipo de tumor, bem como os dados clínicos relevantes. Foram comparadas variáveis clínicas (idade, a presença ou ausência de metástases, recidiva e por fim, seguimento) e variáveis histológicas e biológicas (expressão de recetores hormonais, amplificação de HER2, expressão de Ki-67 e densidade da infiltração linfocitária) entre as duas coortes e correlacionadas estas variáveis entre si e com os dados de seguimento. Um total de 8 correlações foram identificadas, em ambos os carcinomas, entre os vários parâmetros de interesse. Evidencia-se a correlação da expressão de Ki-67 com a infiltração linfocitária peritumoral e intratumoral, que revelaram relações ligeiramente superiores às restantes correlações efetuadas.
- Caracterização da expressão do gene ZFP36L1 associado a mecanismos de patogénese da osteoartrose e osteoporosePublication . Lázaro, Mafalda Guela; Simão, MárcioO organelo sem membrana, designado como grânulo TIS, é caracterizado pela interação da proteína ZFP36 ring finger protein like 1 (ZFP36L1), também conhecida como TIS11B, com mRNAs que codificam proteínas membranares. ZFP36L1 promove o enriquecimento ou exclusão de transcritos, dependendo do tamanho dos seus 3'UTR e número de elementos ricos em adeninas (A) e uracilos (U) (AREs). A associação de grânulos TIS à superfície do retículo endoplasmático cria um microambiente que favorece a tradução e localização de proteínas específicas na superfície da membrana das células. ZFP36L1 também é conhecido por regular a estabilidade e degradação de transcritos de vários genes alvo, como é o caso de vários intermediários inflamatórios, o que sugere um papel duplo para o ZFP36L1, favorecendo a transcrição de proteínas membranares e destabilizando outros alvos. Para além dos marcadores de inflamação, também regula os intermediários da via de sinalização das BMPs e está envolvido em mecanismos de senescência o impacto do ZFP36L1 nas células precursoras de osteoblastos e de condrócitos e na sua diferenciação terminal é praticamente desconhecido. Recentemente, o ZFP36L1 tem sido implicado na promoção da diferenciação de osteoblastos e a sua expressão foi identificada como sendo diminuída em ratinhos mais idosos, resultando numa diferenciação preferencial das células mesenquimais para a linhagem adipocitária. Também foi publicado que o aumento da expressão de ZFP36L1 está associado aos mecanismos de progressão da osteoartrose. Este projeto tem como objetivo a identificação, compilação e discussão de estudos publicados que descrevem a expressão de ZFP36L1 em contextos patológicos associados ao desenvolvimento de osteoporose e osteoartrose, focando a discussão dos resultados obtidos no impacto que ZFP36L1 pode ter no metabolismo do osso e da cartilagem. Através da pesquisa da base de dados Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles) e bibliografia associada vai-se procurar compilar e comparar dados relativos à expressão de ZFP36L1 em experiências usando tecidos de humano e de ratinho. Com base nesses resultados vai-se procurar contextualizar a expressão desta proteína nos mecanismos associados ao desenvolvimento de osteoartrose e osteoporose. Serão igualmente estudadas (i) as relações filogenéticas destes genes nas principais espécies utilizadas como modelos biológicos em ciências biomédicas, e (ii) a presença de polimorfismos no gene que codifica para a ZFP36L1 e possam ser associados a patologias no sistema musculoesquelético e contextualizar os resultados relativamente às funções das proteínas codificadas.
- Complement gene expression in the fetal brain after maternal immune activation in a rodent modelPublication . Correia, Édi Pedro; Hoffmann, CarolinThe developmental stage consists of a wide variety of fine-tuned biological processes. Disruptions in these mechanisms may induce alterations in the fetus, compromising its viability or causing malformations and/or deficits. Pathogens such as bacteria and viruses that cross the placenta have been well established as some of these disruptors with some of these being able to directly harm neurodevelopment. However, the immune system cells themselves have also been described as having a key role in the development of the brain being relevant in processes such as the cortical plate formation and neurogenesis. It is also well known that the mother’s health habits and even diseases are likely to be mirrored on the fetus’ development, since it relies on the mother’s organism for survival. Recent studies have dwelled on the maternal immune system and its effects on development being more specifically focused on its activation by inflammatory signals. Maternal Immune Activation (MIA) during development has been described as having a causative relation to neurodevelopmental disorders, such as schizophrenia, autism specter disorder (ASD), anxiety and depression. Experimental models of MIA can reproduce disease biomolecular alterations and behavioral phenotypes in rodent models. Alongside these findings, the complement system – a group of proteins that play a role in the innate immune response – has also been discovered as having a key role in neurodevelopment, mainly in neuron progenitor cells (NPC) proliferation, migration and differentiation. With both MIA and the complement system having roles in neurodevelopment, this project sets out to evaluate the complement gene expression in fetal brain after MIA in the rodent model using bioinformatics to assess differential gene expression, co-expressed genes and the biological processes in which these are involved. Differential gene expression results of this project proved to be consistent with literature while gene ontology enrichment analysis of co-expressed genes resulted in significant neurodevelopmental biological processes.
- Demonstrating a role of paxillin in adherens junction strengthening and in premalignant to malignant progressionPublication . Rodrigues, Vanessa; Janody, Florence; Carvalhal, SaraBreast cancer poses a substantial threat to women worldwide, often preceded by premalignant lesions that hold potential for progression to invasive cancer. However, accurately predicting which premalignant lesions will progress remains a significant challenge. This study addresses this issue by unravelling the intricate interplay between adherens junctions (AJs) and focal adhesions (FAs) in the progression of premalignant breast cells to invasive cancer. Both AJs and FAs are complex, multifunctional protein assemblies linked to the actin cytoskeleton. Recent advancements in mass spectrometry and adhesion-specific enrichment techniques have elucidated hundreds of proteins constituting integrin and cadherin adhesomes. Nevertheless, these adhesomes compositions are highly variable across cell types and experimental conditions. Despite their traditional distinction, AJs and FAs share numerous signalling molecules, including Paxillin, and are mechanosensitive structures, capable of transducing mechanical cues into transcriptional regulation of cellular processes. Utilizing a human mammary epithelial cell line with conditional Src protooncogene activation, which recapitulates molecular processes in breast cancer progression, the CRC group demonstrated that before undergoing Epithelial to Mesenchymal transition, premalignant MCF10A-ER-Src cells experience a transient state characterized by actomyosin stress fiber accumulation associated with larger FAs, exclusively to cells with E-cadherin/P-cadherin-positive adherens junctions. This mechanical stiffening promotes cell proliferation and amplifies Src activation, propelling cells toward a fully transformed state. In this project we aimed to investigate the influence of Src activation on FA dynamics in premalignant MCF10A-ER-Src cells connected through AJs and to investigate the role of FA component Paxillin, in the progression from premalignant to malignant. The findings obtained are directly aligned with our previous research as the measurements performed on FAs unveils that Src activation triggers the assembly of larger FAs associated with polarized stress fibers in premalignant MCF10A-ER-Src cells connected through AJs. Alongside, we showed that knocking down Paxillin could be an effective tool to weaken FAs strengthening.
- Elucidação do papel de Brachyury no desenvolvimento do sistema nervoso centralPublication . Militão, Inês Torradinhas; Andrade, Raquel; Araújo, InêsBrachyury é um fator de transcrição responsável pelos movimentos morfogénicos durante o processo embriológico da gastrulação para formar as camadas germinativas mesoderme e endoderme. Participa ainda na manutenção de características estaminais das células no botão caudal, garantindo a elongação do eixo anteroposterior do embrião. No adulto, a expressão de Brachyury é diminuta na maioria dos tecidos provenientes da mesoderme, endoderme e ectoderme não-neural. No tecido cerebral adulto, no entanto, é possível detetar expressão de Brachyury. Experiências prévias no laboratório mostraram que Brachyury participa da diferenciação neural, e a diminuição da sua expressão está associada a Gliomas, o tumor mais agressivo do cérebro. Neste trabalho procurou-se compreender quando e onde é expresso Brachyury ao longo do desenvolvimento do sistema nervoso central e qual é a sua função. Através da técnica de hibridação in situ aplicada a embriões de galinha em diversos estadios de desenvolvimento, observou-se que Brachyury é primeiramente expresso nas células da crista neural cranial no estadio HH13 e que, mais tarde, é expresso nas regiões dorsais do telencéfalo e diencéfalo, assim como na região do istmo. Brachyury co-localiza com os genes Pax6 e Wnt8b nestas estruturas. Com recurso à técnica de eletroporação in ovo, foi feita a sobre-expressão de Brachyury e observou-se que não alterou a expressão do gene Wnt8b no cérebro em desenvolvimento. Neste trabalho, foi também iniciada a otimização da técnica de imunohistoquímica in toto, para localização da proteína Brachyury, bem como da técnica de RT-qPCR de forma a genotipar embriões de murganho provenientes do cruzamento de mutantes T+/-, para estudos futuros. É necessário continuar o processo de otimização, focando no desenho de novos primers, os Intron-spanning primers.
- Engineering immunotherapies for thyroid cancerPublication . Silva, Francisca Borges Dias Monteiro da; Tavares, Álvaro; Deckers, JeroenThyroid cancer affects millions of people worldwide, particularly women. While most thyroid cancer patients have a good long-term prognosis, advanced anaplastic thyroid cancer is one of the most aggressive human malignancies. For most patients suffering from anaplastic thyroid cancer, treatment options are severely limited as tumors are resistant to conventional treatments. Anaplastic thyroid cancers typically have a highly immunosuppressive, pro-tumorigenic phenotype, characterized by high levels of immune checkpoint expression and the accumulation of tumor-associated macrophages that can account for more than 50% of the tumor volume. These immune-mediated mechanisms that facilitate rapid tumor growth represent attractive new treatment opportunities, particularly combinations of immunotherapies targeting T-cells and macrophages. The concept of innate immune memory, also known as trained immunity, has recently gained significant attention in the study of the innate immune system. It has also been shown that the induction of trained immunity can help overcome immunosuppression and can be beneficial in the context of cancer. Given this fact, we proposed trained immunity as a therapy target to overcome the characteristic immunosuppressive environment of anaplastic thyroid cancer. The research was conducted to determine the best conditions for inducing trained immunity in bone marrow-derived macrophages. We focused on commonly used primary stimuli such as β-glucan, bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine, and MDP and secondary bacterial stimuli. Furthermore, tumor culture medium was used as a secondary stimulus. Through measurements of cytokine production, we detected the induction of trained immunity in bone marrow-derived macrophages trained with BCG and we observed that factors released by tumor cells can have a comparable effect as bacterial stimuli. We also examined the effect of a tumor on the immune system, looking at the cytokine production of splenocytes and bone marrow-derived macrophages of tumor-bearing mice. At the same time, we analyzed immune cell populations of tumor-bearing mice using flow cytometry, focusing on myeloid, lymphoid, and progenitor cell populations. In summary, this study provides fundamental new knowledge on how to target the bone marrow and induce trained immunity as a new treatment paradigm for anaplastic thyroid cancer.
- Evaluation of the therapeutic effect of human IPSC-derived neuroephitelial stem cells in an immunocompromised lentiviral-induced Machado Joseph Disease mouse modelPublication . Pires, Joana Gonçalo; Mendonça, Liliana Simões; Nóbrega, Clévio; Almeida, Luís Pereira deMachado-Joseph Disease (MJD), or Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3), is a dominantly inherited neurodegenerative disorder caused by CAG repeat expansion in the ATXN3 gene, resulting in a polyglutamine-expanded ataxin-3 protein that forms toxic intranuclear aggregates. With no current disease-modifying therapies, novel approaches targeting the molecular and cellular basis of MJD are urgently needed. This study evaluated the therapeutic potential of neuroepithelial stem cells (Nesc) derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs), both CNT (not bearing the mutant ataxin-3) (CNT NESC) and MJD cells genetically engineered with allele-specific shRNAs targeting mutant ATXN3 RNA (Silenced MJD NESC), following striatal transplantation in NOD/SCID mice injected with lentivirus encoding for mutant ataxin-3 ( lentiviral-induced MJD mouse model). Our results demonstrate that both CNT and silenced MJD NESC are prone to survive up to eight weeks after transplantation into the striatum of NOD/SCID mice also injected with lentivirus encoding for mutant ataxin-3. Both cell types triggered a tendency reduction in the size of the inclusions. Western blot analysis showed a modest, non-significant decrease in high-molecular-weight ATXN3 aggregates in the silenced MJD NESC group. Additionally, no significant differences were observed between CNT mice and CNT and Silenced MJD NESC groups regarding microglia recruitment. RT-qPCR analysis revealed that the striatum of mice transplanted with CNT NESC and Silenced MJD NESC expressed higher Notch1 mRNA levels, and tendency increased for both Bdnf and Ngf mRNA levels. These results demonstrated the ability of NESC to trigger the bystander effects and enhance neurogenesis-related and neurotrophic factors levels after transplantation in the lentiviral-induced MJD mouse model. Collectively, these findings support the therapeutic promise of combining targeted gene silencing of MJD patients’ iPSC-derived NESC with NESC transplantation in MJD mouse models.
- Exploring angiogenesis and cardiomyocyte differentiation in left ventricular noncompaction using patient derived hiPSCPublication . Carmo, Sara Martins do; Bragança, JoséLeft ventricular noncompaction (LVNC), is a rare cardiomyopathy characterized by a spongy myocardial structure, hyper-trabeculation and intra-trabecular recesses, resulting from failure of normal embryonic compaction of the myocardium. The prevalence of LVNC varies globally, between 9.5% in paediatric age and 0.05-0.25% in the general population. Multiple genetic mutations are associated with LVNC, affecting sarcomeric, cytoskeletal and mitochondrial functions. This study investigates the genetic mechanisms underlaying LVNC, focusing on mutations involved in heart diseases and their impact in cardiomyocyte differentiation and angiogenesis, with a special focus on ZSCAN10, SCN10A and VE-PTP, found mutated in the patient’s cells used in this study. Cardiomyocytes were differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from a LVNC patient and a 1st degree healthy relative. Gene relative expression analysis of samples collected during cardiomyocyte differentiation, highlighted significant differences on in key genes, such as GATA4, ISL1, SOX17, KDR, VE-PTP, VEGFA, TNNT2 and NKX2.5 in patients derived cells compared to control cells. Among those, GATA4, ISL1 and NKX2.5, which were previously showed to cooperate for the differentiation and proliferation of cardiomyocytes, presented a significantly lower expression. SOX17, KDR and VEGFA have functions in cardiac vascularization, and the expression of SOX17 was higher in patient’s cells, while in the same conditions KDR and VEGFA were decreased at critical time points for endothelial cells differentiation. Thus, the expression of these genes, crucial for cardiomyocyte development and angiogenesis, were markedly altered in LVNC-derived cells compared to control cells. A Tube formation assay using endothelial cells from both LVNC-derived and control cells, to assess their ability to form capillary like structures. Remarkable differences were observed, with patient cells showing a delayed and an impaired tube formation, and a reduced vascular network complexity. Overall, our results argue that novel genetic and cellular mechanisms might be altered in the LVNC patient cells analysed.
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